معلومة

ما هي "القاعدة الداخلية الإيجابية" عبر الغشاء في الوقت الحاضر؟ هل تغير التعريف بمرور الوقت؟

ما هي



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

التعريف الأول.

قام منشوران من تأليف فون هايجن في عامي 1989 و 1992 بصياغة "قاعدة الداخل الإيجابي" وأظهروا قيمتها العملية في التنبؤ الطوبولوجي للحلزونات عبر الغشاء. تم تعريفه ودليله بوضوح أنه في البكتيريا توجد البقايا الموجبة الشحنة بشكل أكثر شيوعًا في "داخل" الغشاء (السيتوبلازم بدلاً من المحيط).

الأدب الحديث.

ومع ذلك ، يبدو أن المجال قد انتقل بعيدًا عن فكرة "داخل الحجرة" إلى "داخل السيتوبلازم" مع توفر المزيد من البيانات. في مراجعة عام 2006 ، حتى von Heijne يصف بعض حلزونات الغشاء بأنها تلتزم بالقاعدة الداخلية الإيجابية لأن بقاياها موجبة الشحنة كانت داخل السيتوبلازم ، على الرغم من أنها لم تتراجع صراحةً عن التعريف الأصلي. تقدم مراجعة مماثلة في عام 2007 بواسطة von Heijne صقلًا أكثر تحديدًا للقاعدة ، ومع ذلك يزيل المفهوم من أن يكون قابلاً للتطبيق على الأغشية تحت الخلوية.

... تختلف الحلقات التي تربط الحلزونات في تكوين الأحماض الأمينية ، اعتمادًا على ما إذا كانت تواجه داخل الخلية أو خارجها (القاعدة "الموجبة من الداخل").

نحن الآن نواجه قاعدة محرجة لا تأخذ في الحسبان وجود البروتينات في أي مكان آخر في المسار الإفرازي أو في العضيات الأخرى. كل هذه البروتينات موجودة داخل الخلية.

في الآونة الأخيرة ، لا يزال تحليل حلزونات الغشاء من أسطح غشاء بيولوجي مختلفة على نطاق واسع ، Sharpe وآخرون.، 2010 و Baeza-Delgado وآخرون.، 2013 ، أظهر تجميع الشحنة الموجبة كونها عصارة خلوية بدلاً من مناقشتها من حيث داخل المقصورة. لا تزال هاتان الورقتان تقولان إنهما تؤيدان القاعدة الإيجابية من الداخل.

سؤال.

بالنسبة لي ، يبدو أن التعريف قذر إلى حد ما ويمكن استخدامه على نطاق واسع ليقول "داخل السيتوبلازم" ، على الرغم من تردد المنشورات في تحديد القاعدة بوضوح. هل تم تغيير التعريف صراحة ، أو هل غيّر الحقل بصمت معنى "الداخل"؟... أو أنني أساءت تفسير شيء ما تمامًا؟ كيف تتناسب العضيات مع أي من هذه التعريفات؟


أعتقد أنك أساءت فهم الجزء "الداخلي" من "قاعدة الداخل الإيجابي". ربما لأن مصطلح "الداخل" هو في الواقع مصطلح غير دقيق (ولكنه الآن تاريخ ولا يمكن تغييره ؛)). من أجل فهمه بشكل أفضل قليلاً ، من المفيد التفكير في طوبولوجيا الغشاء. أثناء التوليف ، يتم إدخال معظم بروتينات الغشاء (تجاهل بروتينات البيروكسيسومال والميتوكوندريا ، والتي تعد موضوعًا آخر تمامًا) في غشاء ER بواسطة الترانزستور Sec. يتم نضج أجزاء بروتين الغشاء التي تتعرض لللمعة بواسطة جهاز ER و Golgi ليتم عرضها على السطح خارج الخلية. تصنع البروتينات الإفرازية (تلك التي سيتم تصديرها في النهاية من الخلية) بطريقة مماثلة إلا أنها تمر بالكامل عبر الترانكونون وينتهي بها الأمر في تجويف ER. لذلك ، فإن تجويف ER (وبالتالي تجويف حجرات الغشاء الداخلي الأخرى) يتوافق طوبولوجيًا مع الفضاء خارج الخلية ، "الخارج" ، وليس "داخل" الخلية. ربما يكون من الأسهل رؤيته في الصورة (مستعار من هنا: http://www.bioon.com/book/biology/mboc/chapter12/figure12-4.gif "> المقصورات الملونة باللون الوردي تتوافق طوبولوجيتها مع "الخارج" واللون الرمادي عبارة عن أجزاء تتوافق طوبولوجيتها مع "الداخل". لذلك ، بالنسبة لبروتينات الغشاء الموجودة في الجسيم الداخلي ، على سبيل المثال ، بقايا الأحماض الأمينية في التجويف هي في الواقع "خارجية" وليست "داخلية". صحيح أن هذا قد لا يكون واضحًا على الفور لأولئك الذين ليسوا منغمسين بعمق في الميدان. نظرًا لأن الدراسات الأولية استخدمت البكتيريا ، التي لا تحتوي على مقصورات تحت خلوية محاطة بغشاء ، فإن "الداخل" كان بسيطًا ومنطقيًا. ربما كانت "قاعدة إيجابية في السيتوبلازم" أكثر دقة. أتمنى أن يساعدك هذا!


طوبولوجيا بروتين الغشاء

تصف طوبولوجيا بروتين غشائي متكامل العدد والمواقع التقريبية في تسلسل مقاطع الغشاء ، بالإضافة إلى الاتجاه العام للبروتين في الغشاء.

يتم التحكم في الطوبولوجيا بشكل أساسي من خلال كره الماء وطول حلزونات الغشاء بالإضافة إلى توزيع المخلفات الموجبة الشحنة في الحلقات التي تربط الحلزونات.

في معظم الحالات ، يتم تحديد الطوبولوجيا بشكل مشترك أثناء الإدخال بوساطة انتقالية لعديد ببتيد في الغشاء.

الطبولوجيا التي يكون فيها كل من الطرف N والنهاية C للبروتين في السيتوبلازم هي السائدة في كل من الخلايا بدائية النواة وخلايا حقيقية النواة.

تتطور بروتينات الغشاء في المقام الأول عن طريق الازدواج الجيني واندماج الجينات. تشكل العديد من بروتينات الغشاء ثنائيات حيث يكون للسلسلتين المتماثلتين نفس الطوبولوجيا (ثنائيات متوازية) أو طبولوجيا معاكسة (ثنائيات موازية مضادة). يخلق الاندماج الجيني هياكل مكررة داخليًا حيث يتم توجيه نصفي البروتين إما بطريقة موازية أو بطريقة مضادة.


التطورات الحديثة في فهم تجميع البروتين الغشائي وهيكله

لمجموعة متنوعة من الأسباب - وليس أقلها أهمية طبية حيوية - أصبحت بروتينات الغشاء المتكاملة الآن موضع تركيز كبير في العديد من مجالات البيولوجيا الجزيئية ، والكيمياء الحيوية ، والفيزياء الحيوية ، وبيولوجيا الخلية. نما فهمنا للعمليات الأساسية لتجميع البروتين الغشائي ، والطي ، والبنية بشكل ملحوظ في الآونة الأخيرة ، نتيجة للتطورات المنهجية الجديدة ، والمزيد من بيانات الهيكل عالية الدقة ، وإمكانية تحليل بروتينات الغشاء على نطاق الجينوم. مقياس.

إذن ما الجديد في مجال البروتين الغشائي؟ تمت مراجعة جوانب مختلفة لتجميع البروتين الغشائي وهيكله على مدار السنوات القليلة الماضية (Cowan & Rosenbusch ، 1994 Hegde & Lingappa ، 1997 Lanyi ، 1997 von Heijne ، 1997 Bernstein ، 1998) هنا ، سأحاول الجمع بين عدد من الأشياء المثيرة التطورات الأخيرة. وتجدر الإشارة بشكل خاص إلى الاكتشافات المتعلقة بآليات تجميع البروتين الغشائي في الغشاء الداخلي للإشريكية القولونية ، والغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، والطريقة التي يتم بها معالجة أجزاء الغشاء بواسطة شبكة ER.

تشمل التطورات الأخرى دراسات تفصيلية للتفاعل بين الحلزونات الغشائية وطبقة الدهون الثنائية ، وتفاعلات الحشو اللولبي الحلزوني في بيئة الغشاء. أتاح توافر التسلسلات الجينومية الكاملة دراسة بروتينات الغشاء على نطاق الجينوم. أخيرًا ، ظهرت مجموعة من الهياكل ثلاثية الأبعاد الجديدة عالية الدقة.


المواد والأساليب

تركيبات الحمض النووي والمواد الكيميائية

تم إدخال علامة hemagglutinin الثلاثية خارج الخلية (3HA) ، التي تتكون من بقايا الأحماض الأمينية لـ SLEYPYDVPDY-ASYPYDVPDYAYPYDVPD ، في الحلقة الرابعة خارج الخلية بعد البقية 897 في G551D CFTR ، كما هو موصوف للنوع البري (وزن) و ΔF508 وآخرون.، 2004 بيدمونتي وآخرون.، 2005). تم تقديم G551D CFTR (cDNA) من قبل الدكتور ج. رومينز (مستشفى الأطفال المرضى ، تورنتو). تم الحصول على جميع المواد الكيميائية ذات أعلى درجة نقاء متاحة من Sigma-Aldrich (أوكفيل ، أون ، كندا) باستثناء ما هو محدد. كان Bafilomycin A1 (Baf) من مختبرات LC (Woburn ، MA).

الخلايا

نمت خلايا هيلا ، وكلية مادين-داربي للكلاب (MDCK) وخلايا RAW264.7 في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10 ٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS) في حاضنة زراعة الخلايا الحرارية في 5 ٪ CO2 عند 37 درجة مئوية. نمت خلايا الكلى للرضع (BHK) في DMEM / F12 التي تحتوي على 5 ٪ FBS. نمت خلايا IB3 (قدمها الدكتور ب. زيتلين ، جامعة جونز هوبكنز) في وسط قاعدي LHC-8 (Invitrogen ، Carlsbad ، CA) يحتوي على 5٪ FBS. تحتوي خلايا IB3 على النمط الجيني ΔF508 / W1282X (زيتلين وآخرون.، 1991). خط الخلايا الظهارية القصبية البشرية مشتق من مريض التليف الكيسي مع ΔF508/ ΔF508 تم تمييز النمط الوراثي (CFBE41o- ، المعين باسم CFBE) (Cozens وآخرون.، 1994) وتم تربيتها في MEM باستخدام GlutaMAX (Invitrogen ، Carlsbad ، CA) مع 10 ٪ من مصل FBS عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون2- حاضنة ترطيب كما هو موصوف (Gruenert وآخرون.، 1995). للسماح بالتمايز بين MDCK و CFBE ، تمت زراعة الخلايا الظهارية عند التقاء 3-5 أيام. تم الحصول على الضامة الأولية عن طريق غسل الصفاق والقصبات الهوائية كما هو موصوف سابقًا (Guilbault وآخرون.، 2008). تم عزل البلاعم عن طريق الطرد المركزي وتم تعليقها في RPMI 1640 بنسبة 10 ٪ FBS وتم زرعها على أغطية زجاجية مغلفة بالبوليليسين (Sigma). تم طلاء الأغطية طبقاً لتعليمات الشركة الصانعة. تم إجراء التجارب بعد 24-48 ساعة من تصفيح الخلايا.

كانت جميع أنواع الخلايا المستخدمة إما منقولة بشكل عابر أو مستقر بالوزن أو G551D CFTR-3HA التي تحتوي على علامات هيماجلوتينين ثلاثية في الحلقة الرابعة خارج الخلية (شارما وآخرون.، 2004). تم إنشاء خلية BHK تعبر عن الوزن و G551D CFTR-3HA كما هو موصوف سابقًا وتم اختيار الحيوانات المستنسخة في وجود 500 ميكرومتر من ميثوتريكسات (شارما وآخرون., 2001).

تم التعبير عن متغيرات CFTR بثبات في خلايا CFBE و HeLa باستخدام نواقل lentiviral بواسطة Dr.J. وآخرون.، 2005). تم نقل ظهارة القصبات الهوائية IB3 ، التي تعبر عن ΔF508 و W1282X CFTR بمستويات لا يمكن اكتشافها ، بشكل ثابت باستخدام تعبير pCEP4 البلازميد الذي يشفر الوزن أو G551D CFTR-3HA. تم اختيار خليط من الحيوانات المستنسخة في hygromycin B. تم الحفاظ على الخلايا المنقولة في LHC-8 التي تحتوي على 5 ٪ FBS و 100 ميكروغرام / مل -1 hygromycin B. تم نقل خلايا RAW بشكل عابر باستخدام تشفير CFTR pNut-CFTR باستخدام FuGENE6 كعامل معقد للحمض النووي ( روش ، بازل ، سويسرا) وفقًا لتوصية الشركة الصانعة وتحليلها بعد 48 ساعة. أصيبت خلايا MDCK بالفيروس القهقري الذي يشفر متغيرات CFTR-3HA كما هو موصوف سابقًا (Benharouga وآخرون., 2003).

الحيوانات

إنبريد C57BL / 6-Cftr +/ الفئران غير المتجانسة تمت صيانتها وتربيتها في مرفق الحيوان التابع لمعهد أبحاث المركز الصحي بجامعة ماكجيل. تم التنميط الجيني لجميع الجراء بين 12 و 14 يومًا من العمر. تم الاحتفاظ بالحيوانات في أقفاص مع أغطية ذرة معقمة (Anderson ، Bestmonro ، LA) وتم الاحتفاظ بها في رفوف جيدة التهوية (Lab Products ، Seaford ، DE). C57BL المطابق للعمر / 6-Cftr + / + الفئران و C57BL / 6-Cftr - / - تم الحفاظ على الفئران في مسببات أمراض الفئران- ، هيليكوباكتر- وظروف خالية من الطفيليات. تم إيواؤهم (1-4 حيوانات / قفص) ، وتربيتهم ، وصيانتهم في منشأة تحت ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض. تم إطعام الفئران إما بنظام NIH-31 المعدّل والمعالج بالإشعاع للفئران بالوزن (Harlan Teklad ، Indianapolis ، IN) أو نظام غذائي سائل بدءًا من 14 يومًا للفئران بالضربة القاضية (نظام Peptamen Liquid Diet ، Nestlé Canada ، Brampton ، ON ، كندا). تم تحضير النظام الغذائي السائل طازجًا كل صباح وتم توفيره في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل (Fisher Scientific ، Nepean ، ON ، كندا). تراوحت أعمار الفئران المستخدمة في التجارب بين 19 و 22 أسبوعًا. تم إجراء الإجراءات التجريبية مع الفئران وفقًا لإرشادات المجلس الكندي لرعاية الحيوان وبموافقة لجنة رعاية حيوانات المنشأة التابعة لمعهد أبحاث مستشفى مونتريال العام (مونتريال ، بي كيو ، كندا).

وسم العضيات الداخلية باستخدام أصباغ حساسة لدرجة الحموضة

تم تحديد الرقم الهيدروجيني اللامعي للاندوسومات المبكرة وإعادة التدوير والليزوزومات والبلعومات بشكل روتيني بعد وضع العلامات الانتقائية للمقصورة المعنية مع فلورسين أيزوثيوسيانات ترانسفيرين (FITC) - البضائع المقترنة (على سبيل المثال ، CFTR ، ترانسفيرين ، ديكستران ، و P. الزنجارية PAO1) بواسطة FRIA كما هو موصوف لـ CFTR وجزيئات الشحن الأخرى (Sharma وآخرون.، 2004 باريير وآخرون.، 2007 كومار وآخرون.، 2007 Barriere and Lukacs، 2008 Duarri وآخرون.، 2008 فارغيز وآخرون.، 2008 جلوزمان وآخرون., 2009).

لتسمية CFTR الداخلي ، تم تحضين الخلايا بمضاد HA (تخفيف 1: 500 ما يعادل 10 ميكروغرام / مل ، MMS101R ، مختبرات كوفانس ، ماديسون ، ويسكونسن) الابتدائية Ab و FITC مترافق مع ماعز مضاد للفأر FITC ثانوي (تخفيف 1: 500 ، Jackson ImmunoResearch Laboratories ، West Grove ، PA) عن طريق احتضان الابتدائي لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. تم بعد ذلك غسل الخلايا (140 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار HEPES ، 10 ملي مولار من الجلوكوز ، 0.1 ملي كلوريد الكالسيوم.2، و 1 ملي MgCl2، ودرجة الحموضة 7.3) ومطاردة للوقت المحدد عند 37 درجة مئوية. لم يكن امتصاص Abtake في المرحلة السائلة قابلاً للاكتشاف في الخلايا المنقولة الوهمي (البيانات غير معروضة). عند الإشارة ، تم تمييز CFTR الموجود على سطح الخلية على الجليد عن طريق الحضانة المتتالية باستخدام مضاد HA Ab الأساسي والثانوي FITC-Fab.

لتأكيد أن Ab الابتدائي والثانوي يظل مرتبطًا بـ CFTR أثناء تجارب FRIA ، تم قياس مقاومة الأس الهيدروجيني لربط AB بواسطة مقايسة immunoperoxidase. بعد ارتباط AB الثانوي المقترن بـ HA و HRP بخلايا هيلا التي تعبر عن CFTR ، تم تعديل الأس الهيدروجيني المتوسط ​​خارج الخلية إلى الرقم الهيدروجيني 7.2 و 5.0 و 2.5 لمدة 5 دقائق (فان كيركوف وآخرون.، 2001 0.15 مول كلوريد الصوديوم ، 50 ملي جلايسين ، 0.1٪ جيش صرب البوسنة ، 20 ملي مولار ، للرقم الهيدروجيني 2.5 و 5.0 ، 10 ملي مولار HEPES للرقم الهيدروجيني 7.2). تم قياس مقدار Ab المترافق من HRP المحدود بواسطة Amplex-Red كركيزة ، باستخدام قارئ لوحة مضان POLARstar OPTIMA (BMG Labtech ، Offenburg ، Germany Barriere وآخرون.، 2006). لم يتغير ارتباط Ab فعليًا عند درجة الحموضة 5.0 ، ولكن تم تقليله بنسبة 50 ٪ عند درجة الحموضة 2.5 (الشكل التكميلي S1A).

تم تصنيف الإندوسومات المعاد تدويرها باستخدام FITC-transferrin (Tf 15 ميكروغرام / مل ، تحميل 45 دقيقة بعد 45 دقيقة من نضوب المصل عند 37 درجة مئوية) ومطاردتها لمدة 0-3 دقائق. تم قياس الأس الهيدروجيني الليزوزومي بنتائج مماثلة على الخلايا المسمى بامتصاص طور السائل طوال الليل لـ FITC-dextran بمفرده أو بالاشتراك مع Oregon Green 488-dextran (50 ميكروغرام / مل ، MW 10 كيلو دالتون ، مجسات جزيئية ، يوجين ، أو) ومطاردة من أجل & GT3 ح.

تمت مراقبة phagosomal pH بعد امتصاص FITC- أو FITC / TRITC- مترافق P. الزنجارية (سلالة PAO1 ، مقدمة من الدكتور م. بارسيك ، جامعة واشنطن ، سياتل). من ثقافة بين عشية وضحاها ، تم طمس بكتيريا ∼5 × 10 8 في 20 ٪ FBS-PBS لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع التحريض. تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني وتم وضع علامة عليها في وجود 1 مجم / مل من FITC أو TRITC أو مزيج من كليهما في PBS عند درجة الحموضة 8.0 لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة تحت الدوران. تمت إزالة الفائض من الأصباغ الفلورية عن طريق الطرد المركزي المتكرر في PBS المثلج. تم تجميد البكتيريا المفاجئة وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

قياس درجة الحموضة العضوي

تم إجراء FRIA للعضيات الملتصقة على مجهر مضان مقلوب Axiovert 100 (Carl Zeiss MicroImaging ، تورونتو ، أونتاريو ، كندا) في درجة حرارة الغرفة مجهزة بكاميرا Hamamatsu ORCA-ER 1394 (Hamamatsu ، اليابان) مبردة CCD وكاميرا Planachromat (63 × NA) 1.4) الهدف بشكل أساسي كما هو موضح سابقًا (Sharma وآخرون.، 2004 باريير وآخرون.، 2007 Barriere and Lukacs ، 2008 Glozman وآخرون.، 2009). تم إجراء الحصول على الصور و FRIA باستخدام برنامج MetaFluor (الأجهزة الجزيئية ، داونينجتاون ، PA). تم الحصول على الصور بأطوال موجية إثارة تبلغ 490 ± 5 و 440 ± 10 نانومتر ، باستخدام مرشح انبعاث 535 ± 25 نانومتر. لتحديد المعدلات الأولية لتحمض الإندوسومات (انظر الشكل 4E) ، تم تصنيف CFTR بـ Fab الماعز المضاد للفأر المترافق مع HA و FITC بالتتابع لمدة ساعة واحدة على الجليد ومطاردته عند 37 درجة مئوية للأوقات المحددة. تم تجريد سطح الخلية المتبقي Abs من الحمض قبل الحصول على الصورة (van Kerkhof وآخرون., 2001).

منحنيات المعايرة في الموقع ، التي تصف العلاقة بين قيم نسبة التألق ودرجة الحموضة الداخلية أو الليزوزوم أو phagosome ، تعمل على حساب الرقم الهيدروجيني اللامع للحويصلات الفردية بعد طرح الخلفية الفلورية في كل من أطوال موجات الإثارة (على سبيل المثال ، الشكل التكميلي S1 ، B-D) . تم إجراء المعايرة في الموقع عن طريق تثبيت الأس الهيدروجيني الحويصلي بين 4.5 و 7.4 في وسط غني بالبوتاسيوم (135 ملي مول كلوريد ، 10 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار HEPES ، أو 20 ملي مولار MES ، 1 ملي MgCl2، و 0.1 ملي كلوريد الكالسيوم2) مع 10 ميكرومتر نيجيريسين ، 10 ميكرومتر مونينسين ، 0.4 ميكرومتر Baf ، و 20 ميكرومتر كربونيل سيانيد 3-كلوروفينيل هيدرازون (CCCP Sigma-Aldrich) وتسجيل نسب التألق. تم الحصول على منحنيات المعايرة لكل جزيئات شحن وتكررت على فترات منتظمة. كعنصر تحكم داخلي ، تم إجراء معايرة من نقطة واحدة على كل غطاء من خلال تثبيت الأس الهيدروجيني العضوي إلى 6.5 مع 10 ميكرومتر monensin و nigericin و 0.4 ميكرومتر Baf و 20 ميكرومتر CCCP. في كل تجربة تم تحديد الرقم الهيدروجيني لـ 200-800 إندوسوم / ليسوسوم و 100-400 بلعمية. تم الحصول على توزيعات غاوس أحادية أو متعددة السكتات لقيم الأس الهيدروجيني الحويصلي باستخدام برنامج Origin 7.0 (OriginLab ، Northampton ، MA) ، وتم توضيح نتائج التجارب الفردية. تم حساب متوسط ​​الرقم الهيدروجيني لكل مجموعة حويصلة كمتوسط ​​حسابي للبيانات في كل تجربة فردية باستخدام 200-800 حويصلة من 15 إلى 60 خلية. تم إجراء ثلاث تجارب مستقلة على الأقل لكل حالة.

تحديد نفاذية المضاد النسبية والقدرة العازلة للعضيات

تم استخدام التبديد السريع لتدرج الأس الهيدروجيني العضوي بواسطة مثبط مضخة البروتون (Baf) وحامل البروتون (CCCP) لتحديد نفاذية التناقض النسبية للعضيات. تم تصنيف الخلايا على النحو الموصوف أعلاه وتمت مراقبة الأس الهيدروجيني العضوي باستمرار بواسطة FRIA للوقت المحدد. تم قياس تبديد الأس الهيدروجيني في وجود 0.4 ميكرومتر Baf و 20 ميكرومتر CCCP. لقياس تسرب البروتون السلبي ، تمت إضافة Baf فقط. تم استخدام كل من Baf و CCCP بتركيزات مشبعة (Lukacs وآخرون.، 1990 ، 1991 Hackam وآخرون.، 1997 شتاينبرغ وآخرون.، 2007 ب). عند الإشارة ، تم تنشيط CFTR باستخدام كوكتيل ناهض PKA (20 ميكرومتر forskolin ، 0.5 ملي مولار 8- (4-chlorophenyl-thio) أدينوزين 3 ، 5′-cyclic monophosphate ملح الصوديوم [CPT-cAMP] ، و 0.2 ملي إيزوبيوتيل ميثيل زانثين [IBMX ]) لمدة 3 دقائق قبل إضافة Baf + CCCP. تم إجراء FRIA كما هو موضح أعلاه. تم حساب معدل تبديد الأس الهيدروجيني من المنحدر الأولي لتغيير نسبة التألق. تم حساب السعة العازلة للعضيات الداخلية من مدى القلوية السريعة بعد إضافة 0.5 - 2 ملي مولار NH4Cl في وجود أو عدم وجود Baf. استند الحساب إلى الصيغة من Roos and Boron (Roos and Boron، 1981 Sonawane and Verkman، 2003).

تحديد نفاذية البروتون السلبي

تم حساب نفاذية البروتون السلبية لإعادة تدوير الإندوسومات والجسيمات الحالة والبلعمة وفقًا للمعادلة التالية: أين صح + هي نفاذية البروتون السلبي العضوي بوحدات cm · s −1، dpHا/ dt هو تدفق البروتون العضوي في pH · s −1 ، V هو الحجم العضوي بالسنتيمتر 3 ، S هو السطح العضوي بالسنتيمتر 2 ، βالخامس هي سعة المخزن العضوي في M · pH −1 ، و ([H +]ا - [H +]ج) ، هو التدرج البروتوني عبر الغشاء بين تجويف العضية والعصارة الخلوية (Chandy وآخرون.، 2001 Grabe and Oster، 2001).تم قياس تدفق البروتون السلبي من خلال مراقبة معدل القلونة العضوي مباشرة بعد إضافة 400 نانومتر Baf كما هو موضح في الشكل 2 د. تم قياس السعة العازلة من خلال مراقبة القلوية السريعة للعضيات بعد NH44إضافة Cl في وجود Baf كما هو مفصل في المواد والأساليب وفي تشاندي وآخرون. (2001). تم الحصول على سطح وحجم الإندوسومات والليزوزومات من البيانات المنشورة (Griffiths وآخرون.، 1989). استند حجم البلعمة وحساب السطح إلى افتراض أن متوسط ​​قطر البلعوم يبلغ 3 ميكرون والمسافة بين الجدار البكتيري والورقة الداخلية للغشاء البلعمي هي 100 نانومتر ، بناءً على ملاحظات EM (Hart et al. ، 1987 Chastellier ، 2008). في ضوء الموصلية المضادة العالية للعضيات الداخلية وإمكانات الغشاء المتواضعة للبلسم (& lt25 mV بما في ذلك تأثير Donnan المحتمل Steinberg et al. ، 2007b) ، افترضنا أن إمكانات الغشاء لها مساهمة متواضعة في القوة الدافعة الكهروكيميائية للبروتون في العضيات الداخلية. لذلك ، تم حساب نفاذية البروتون السلبية من خلال الأخذ في الاعتبار فقط القوة الدافعة للبروتون الكيميائي ، وبالتالي من المحتمل أن تمثل تقديرًا مبالغًا فيه. تم افتراض أن الرقم الهيدروجيني السيتوبلازمي ثابت (pH 7.3) أثناء قياسات تدفق البروتون (Mukherjee وآخرون., 1997).

الفحص المجهري المناعي

تم تحديد التوزيع الخلوي CFTR بعد استيعاب مضاد HA Ab لمدة ساعة واحدة في DMEM ومطاردته لمدة 0.5 ساعة. تم تصور CFTR بواسطة فاب الماعز المضاد للفأر المترافق مع FITC أو ماعز الماعز المترافق مع TRITC بعد تثبيت الخلية. خلال الـ 45 دقيقة الماضية ، تم تصنيف الخلايا بـ FITC-Tf أو TRITC-Tf (15 ميكروغرام / مل) بعد 45 دقيقة من نضوب المصل لتصور إعادة التدوير الإندوسومات. تم الكشف عن علامة الجسيم الداخلي المبكرة 1 (EEA1) و Rab5 عن طريق التلوين المناعي غير المباشر باستخدام الأجسام المضادة المضادة لـ EEA-1 والأجسام المضادة لـ Rab5 للأرنب من Abcam (كامبريدج ، المملكة المتحدة) و Santa Cruz Biotechnology ، (سانتا كروز ، كاليفورنيا) ، على التوالي. تم تصنيف الليزوزومات باستخدام FITC-dextran (50 ميكروغرام / مل ، ميغاواط 10 كيلو دالتون) كما هو موصوف لتحديد الرقم الهيدروجيني. في بعض التجارب ، كان الليزوزوم ملطخًا بمضاد الفأر أحادي النسيلة Ab (H4B4 Ab تم تطويره من قبل الدكتور ج. ، قسم العلوم البيولوجية ، مدينة آيوا ، أيوا). تم جمع المقاطع البصرية المفردة بواسطة مجهر متحد البؤر بالليزر Zeiss LSM510 ، ومجهز بـ Plan-Apochromat 63X / 1.4 (Carl Zeiss Microimaging ، Thornwood ، NY) كما هو موصوف (Lechardeur وآخرون.، 2004). تمت معالجة الصور باستخدام برنامج Adobe Photoshop (Adobe Systems ، San Jose ، CA). تم قياس التلقيح البلعومي CFTR عن طريق استيعاب مضاد HA Ab المركب مع IgG الماعز المترافق مع الفأر TRITC لمدة 1 ساعة في DMEM ومطاردته لمدة 0.5 ساعة ، ثم تم بلعم بكتيريا FITC-PAO1 في الوقت المحدد. تم إجراء عملية التلوين باستخدام ميزة "Colocalization" في برنامج Volocity 4.1.0 (برنامج تحسين الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale ، CA) كما هو موضح في المواد التكميلية.

النشاف الغربي

تم تحديد مستوى تعبير CFTR لخطوط الخلايا عن طريق التكتل المناعي باستخدام مضادات HA (MMS101R ، Covance) للخلايا الظهارية أو الأجسام المضادة لـ CFTR (M3A7 و L12B4 ، Chemokine ، East Orange ، NJ) للبلاعم. تم تحضير محلول الخلية باستخدام محلول RIPA يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من لوبيبتين ، بيبستاتين ، 100 ميكرومتر من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل ، 10 ميكرومتر MG132 ، و 10 ملي مولار. ن-إيثيل ماليميد ، وتم إجراء التلطخ المناعي لـ CFTR كما هو موصوف سابقًا باستخدام التلألؤ الكيميائي المحسن (شارما وآخرون., 2004).

فحص تدفق اليوديد

تم تحديد توصيل هاليد غشاء البلازما المعتمد على cAMP للخلايا المنقولة والوالدية مع تدفق يوديد كما هو موصوف (شارما وآخرون.، 2001). الخلايا الأبوية ليس لديها أو لديها كمية ضئيلة من تصرف هاليد تنشيط cAMP. تمت إضافة مثبط CFTR MalH2 (الذي قدمه الدكتور A. Verkman ، جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو) في وقت واحد مع كوكتيل ناهض PKA الذي يحتوي على 20 ميكرومتر من فورسكولين و 0.5 ملي مولار CPT-cAMP و 0.2 ملي مولار من IBMX. تم تحديد حساسية الأس الهيدروجيني لتدفق اليوديد بعد احتضان الخلايا عند الرقم الهيدروجيني 5 خلال آخر 10 دقائق من تحميل اليوديد وقياس التدفق في تحميل مكمل بـ 20 ملي مولار ومخزن دفق مؤقت ، على التوالي. تمت معايرة القطب الكهربي الانتقائي لليوديد في المحطة MES المحتوية على عازلة عند الرقم الهيدروجيني 5.

تحليل احصائي

تم تكرار التجارب ثلاث مرات على الأقل أو كما هو محدد. البيانات تعني ± SEM. تم تقييم الدلالة من خلال حساب قيم p ثنائية الذيل بمستوى ثقة 95٪ مع قيمة غير مقترنة ر اختبار باستخدام برنامج Prism (برنامج GraphPad ، سان دييغو ، كاليفورنيا).


3 نتائج

3.1 التفاعلات البينية في أجهزة الصراف الآلي: مقارنة بـ BTM و GLOB

قمنا بتحليل التفاعلات بين المخلفات في منطقة TM المكونة من 3462 حلزونة من 430 بروتينًا (مجموعة بيانات ATM ، انظر القسم 2). تتوفر التهم المطلقة للتفاعلات في الجدول التكميلي S2. يتم تقديم النتائج كخرائط حرارة تعرض: (1) جميع التفاعلات (الشكل 1 أ) ، (2) تلك الموجودة في داخل البروتين (الشكل 1 ب) أو في سطح البروتين المعرض للدهون (الشكل 1 ج) ، (3) ) تلك الأنواع بين الحلزونية (الشكل 1 د) أو داخل الحلزونية (الشكل 1E) و (4) التفاعلات التي تتضمن إما سلسلة جانبية أو سلسلة جانبية أو عمود فقري أو اتصالات العمود الفقري (الشكلان التكميليان S1 و S2). يتم عرض مشاركة كل بقايا في العدد الإجمالي للتفاعلات بين المخلفات في الجدول 1. توزيع الترددات النسبية للتفاعلات بين المخلفات في ATM يقدم ملفًا شخصيًا غير متجانس مع مشاركة جديرة بالملاحظة من المخلفات الأليفاتية ، تليها العطرية والقطبية المخلفات (بشكل رئيسي Ser و Thr) ، وشارك عدد قليل جدًا من التفاعلات بواسطة المخلفات المشحونة. تشتمل أزواج المخلفات - البقايا الأكثر شيوعًا على جميع مجموعات المخلفات الأليفاتية و Phe ، خاصة Leu-Phe و Leu-Ile و Leu-Val. من الواضح أن التفاعلات التي تشتمل على بقايا أليفاتية متفرعة تظهر بشكل رئيسي على سطح البروتين ، بينما تحدث التفاعلات التي تتضمن Ala غالبًا في داخل البروتين (الشكل 1B و C). هناك أيضًا العديد من التفاعلات للمخلفات الأليفاتية أو Phe مع Ser أو Thr. على النقيض من ذلك ، هناك عدد قليل من التفاعلات القطبية أو المشحونة أو المشحونة القطبية ، على الرغم من دورها المعروف في عمل البروتين (مولر) وآخرون.، 2008) (الشكل 1 ح). تحدث هذه التفاعلات بشكل رئيسي في لب البروتين. التفاعلات بين الحلزونية ثلاثية التفاعلات داخل الحلزونية ويتم إجراؤها بشكل أساسي عن طريق تفاعلات السلسلة الجانبية للمخلفات الكارهة للماء و Phe والتفاعلات بين السلسلة الجانبية للمخلفات الكارهة للماء و Phe والعمود الفقري لبقايا Gly و Ala (انظر الشكل 1D والشكل التكميلي 1D). S2). يتم إجراء التفاعلات داخل الحلزونية بشكل أساسي بواسطة بقايا Pro و Ser و Thr التي تتفاعل من خلال السلسلة الجانبية الخاصة بها مع العمود الفقري للمخلفات في المنعطف السابق وأيضًا مساهمة طفيفة للتفاعلات الكارهة للماء و Phe sidechain-sidechain (انظر الشكل 1E والشكل التكميلي S1). S2).

توزيع التفاعلات في أجهزة الصراف الآلي مقارنة بمجموعات BTM و GLOB. خرائط الحرارة لتكرار التفاعلات بين المخلفات بواسطة أزواج المخلفات المقيسة بالعدد الإجمالي للتفاعلات في (أ) مجموعة أجهزة الصراف الآلي ، (ب) الداخلية (ATM IN) و (ج) سطح (ATM OUT) من أجهزة الصراف الآلي ، (د) بين الحلزونية (INTER) و (هـ) داخل الحلزون (INTRA) في أجهزة الصراف الآلي (F) مجموعة BTM و (ز) مجموعة GLOB α-helical. (ح) صافي الرسم الذي يمثل النسبة المئوية للتفاعلات بين المخلفات المجمعة حسب أنواع المخلفات: العطرية (Trp ، Tyr و Phe) ، الأليفاتية (Ile ، Leu ، Val and Ala) ، Gly – Pro ، الكبريت المحتوي على (Met and Cys) ، القطبية ( Ser و Thr و Asn و Gln) والمخلفات المشحونة (His و Arg و Lys و Glu و Asp). لم تؤخذ في الاعتبار تفاعلات العمود الفقري والعمود الفقري في هذه المؤامرات

توزيع التفاعلات في أجهزة الصراف الآلي مقارنة بمجموعات BTM و GLOB. خرائط الحرارة لتكرار التفاعلات بين المخلفات بواسطة أزواج البقايا المقيسة بالعدد الإجمالي للتفاعلات في (أ) مجموعة أجهزة الصراف الآلي ، (ب) الداخلية (ATM IN) و (ج) سطح (ATM OUT) من أجهزة الصراف الآلي ، (د) بين الحلزونية (INTER) و (هـ) داخل الحلزون (INTRA) في أجهزة الصراف الآلي (F) مجموعة BTM و (ز) مجموعة GLOB α-helical. (ح) صافي الرسم الذي يمثل النسبة المئوية للتفاعلات بين المخلفات المجمعة حسب أنواع المخلفات: العطرية (Trp ، Tyr و Phe) ، الأليفاتية (Ile ، Leu ، Val and Ala) ، Gly – Pro ، الكبريت المحتوي على (Met and Cys) ، القطبية ( Ser و Thr و Asn و Gln) والمخلفات المشحونة (His و Arg و Lys و Glu و Asp). لم تؤخذ في الاعتبار تفاعلات العمود الفقري والعمود الفقري في هذه المؤامرات

عدد المخلفات والمشاركة في التفاعلات بين المخلفات لكل بقايا في أجهزة الصراف الآلي

. عدد المخلفات. المشاركة في التفاعلات بين المخلفات.
عدد المخلفات المتفاعلة. . عدد التفاعلات.
TRP1846 (2.6%) 6801 (3.6%) عطرية 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) عطرية 31 650 (33.8%)
صور2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
إيل7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) أليفاتية 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) أليفاتية 62 300 (66.6%)
ليو11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
فال7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
علاء8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
جلاي6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly – Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly – Pro 15 597 (16.7%)
طليعة1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
التقى2612 (3.7%) 8689 (4.6%) تحتوي على الكبريت 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) تحتوي على الكبريت 11 190 (12.0%)
السيستئين1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
سر 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) قطبي 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) قطبي 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
أسن 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
جلن 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
له 819 (1.2%) 2597 (1.4%) متهم 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) متهم 10 702 (11.4%)
أرج 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
ليس 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
غلو 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
آسيا والمحيط الهادئ 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)
. عدد المخلفات. المشاركة في التفاعلات بين المخلفات.
عدد المخلفات المتفاعلة. . عدد التفاعلات.
TRP1846 (2.6%) 6801 (3.6%) عطرية 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) عطرية 31 650 (33.8%)
صور2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
إيل7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) أليفاتية 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) أليفاتية 62 300 (66.6%)
ليو11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
فال7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
علاء8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
جلاي6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly – Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly – Pro 15 597 (16.7%)
طليعة1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
التقى2612 (3.7%) 8689 (4.6%) تحتوي على الكبريت 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) تحتوي على الكبريت 11 190 (12.0%)
السيستئين1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
سر 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) قطبي 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) قطبي 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
أسن 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
جلن 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
له 819 (1.2%) 2597 (1.4%) متهم 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) متهم 10 702 (11.4%)
أرج 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
ليس 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
غلو 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
آسيا والمحيط الهادئ 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)

الأعداد والنسب المطلقة (بين قوسين) لكل حمض أميني على تكوين وعدد البقايا المتفاعلة والتفاعلات في مجموعة أجهزة الصراف الآلي. يتم حساب النسب المئوية لعدد المخلفات المتفاعلة وعدد التفاعلات لكل بقايا (أو مجموعة من المخلفات) مقسومة على العدد الإجمالي للمخلفات المتفاعلة (187186) وعلى إجمالي عدد التفاعلات (93593) ، على التوالي. لم يتم تناول تفاعلات العمود الفقري والعمود الفقري في هذا الجدول.

عدد المخلفات والمشاركة في التفاعلات بين المخلفات لكل بقايا في أجهزة الصراف الآلي

. عدد المخلفات. المشاركة في التفاعلات بين المخلفات.
عدد المخلفات المتفاعلة. . عدد التفاعلات.
TRP1846 (2.6%) 6801 (3.6%) عطرية 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) عطرية 31 650 (33.8%)
صور2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
إيل7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) أليفاتية 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) أليفاتية 62 300 (66.6%)
ليو11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
فال7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
علاء8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
جلاي6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly – Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly – Pro 15 597 (16.7%)
طليعة1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
التقى2612 (3.7%) 8689 (4.6%) تحتوي على الكبريت 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) تحتوي على الكبريت 11 190 (12.0%)
السيستئين1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
سر 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) قطبي 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) قطبي 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
أسن 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
جلن 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
له 819 (1.2%) 2597 (1.4%) متهم 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) متهم 10 702 (11.4%)
أرج 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
ليس 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
غلو 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
حي 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)
. عدد المخلفات. المشاركة في التفاعلات بين المخلفات.
عدد المخلفات المتفاعلة. . عدد التفاعلات.
TRP1846 (2.6%) 6801 (3.6%) عطرية 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) عطرية 31 650 (33.8%)
صور2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
إيل7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) أليفاتية 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) أليفاتية 62 300 (66.6%)
ليو11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
فال7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
علاء8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
جلاي6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly – Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly – Pro 15 597 (16.7%)
طليعة1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
التقى2612 (3.7%) 8689 (4.6%) تحتوي على الكبريت 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) تحتوي على الكبريت 11 190 (12.0%)
السيستئين1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
سر 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) قطبي 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) قطبي 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
أسن 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
جلن 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
له 819 (1.2%) 2597 (1.4%) متهم 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) متهم 10 702 (11.4%)
أرج 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
ليس 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
غلو 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
حي 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)

الأعداد والنسب المطلقة (بين قوسين) لكل حمض أميني على تكوين وعدد البقايا المتفاعلة والتفاعلات في مجموعة أجهزة الصراف الآلي. يتم حساب النسب المئوية لعدد المخلفات المتفاعلة وعدد التفاعلات لكل بقايا (أو مجموعة من المخلفات) مقسومة على العدد الإجمالي للمخلفات المتفاعلة (187186) وعلى إجمالي عدد التفاعلات (93593) ، على التوالي. لم يتم تناول تفاعلات العمود الفقري والعمود الفقري في هذا الجدول.

لأغراض المقارنة ، قمنا بتحليل مجموعة من 129 BTMs ومجموعة من 1231 حزمة (19861 حلزونيًا) من GLOB α-helical (انظر القسم 2 الجدول التكميلي S2 والتين التكميلي S1 و S3). يختلف توزيع التفاعلات التي لوحظت لمجموعة أجهزة الصراف الآلي بشكل ملحوظ عن تلك الملاحظة لمجموعة BTM (الشكل 1F والجدول التكميلي S3 و S4). يُظهر الأخير توزيعًا أكثر تجانسًا للتفاعلات ، مع تفاعلات أقل أليفاتية - أليفاتية وأليفاتية - قطبية وتفاعلات أكثر تشاركًا بالعطرية. تمثل Tyr أعلى مشاركة في التفاعلات بين المخلفات. نظرًا لأن لب البروتين في البراميل محبة للماء ، فإن ترددات التفاعلات القطبية - القطبية ، والقطبية - المشحونة والمشحونة تكون أكبر. يتشابه توزيع التفاعلات في مجموعة GLOB بشكل ملحوظ مع مجموعة ATM (انظر الشكل 1G والجدول التكميلي S3 و S4). تتميز مجموعة GLOB بتردد مماثل للتفاعلات القطبية مقارنة بمجموعة ATM ، وتفاعلات مشحونة أكثر وتفاعلات أليفاتية أقل تتضمن بقايا غير Leu.

3.2 دور المخلفات في أجهزة الصراف الآلي: مقارنة بـ BTM و GLOB

لفهم دور كل بقايا في التفاعلات بين المخلفات الموصوفة أعلاه في النواب (الشكل 1 والشكلان التكميليان S1 و S2) ، من المهم معرفة تفضيل كل بقايا (أو مجموعات من البقايا) لمواقع محددة داخل الحزمة : لداخل البروتين أو للسطح ، ولمناطق الأغشية العميقة أو المناطق البينية. مع هذا الغرض ، قمنا بتحليل تواتر وتوزيع كل حمض أميني مع الأخذ في الاعتبار البروتين الكلي (ALL) ، والمخلفات الموجودة إما في قلب البروتين (IN) أو في سطح البروتين المعرض للدهون (OUT) (انظر الشكل 2 أ والتكميلي. الجدول S5). نظرنا أيضًا في توزيع البقايا على طول ملف تعريف الغشاء (انظر الشكل 2D والشكل التكميلي S4). تُظهر هذه البيانات أن العديد من المخلفات تظهر بالفعل تفضيلًا ملحوظًا لوقوعها في الجزء الداخلي من البروتين أو مواجهة طبقة ثنائية الدهون ، وللتمدد في مركز مقاطع TM أو عند أحد الطرفين أو كليهما (خارج الخلية والهيولي). ترد في الجدول 1. ترددات كل بقايا ومجموعات من المخلفات والمشاركة في العدد الإجمالي للتفاعلات. مجموعة (الشكل 1) تمثّل تمثيلاً زائداً أو ناقصاً إحصائياً (الشكل التكميلي S5) مقارنةً بما يمكن توقعه بافتراض التفاعلات العشوائية بناءً على التركيبة المرصودة (ترددات الأحماض الأمينية في الجدول 1 والجدول التكميلي S5). تم إجراء نفس التحليل ، لأغراض المقارنة ، في مجموعات BTM و GLOB (الشكل 2F و G ، الجدول التكميلي S5 والشكل التكميلي S6).

التركيب والتوزيع والتوطين المفضل لكل حمض أميني. توزيع ترددات الأحماض الأمينية (أعلى) ومجموعات المخلفات (انظر أسفل الشكل 1 للتعرف على مجموعات المخلفات) في أجهزة الصراف الآلي (أ)، BTM (ب) و GLOB (ج) مجموعات البيانات. تظهر أيضًا المساهمة من المخلفات في داخل البروتين (IN) أو في سطح البروتين (OUT). * يشير إلى الفروق الإحصائية (ص & lt 0.05) بين ترددات IN و OUT في اختبار χ2 لملاءمة الجودة مع تصحيحات Bonferroni. (د) تسلسل الشعارات لتكوين البقايا على طول حلزونات TM لمجموعة بيانات ATM. تم إنشاء الصورة باستخدام WebLogo (Crooks وآخرون.، 2004). لكل حلزون ، يعتمد مركز الغشاء (المحدد عند 0 Å) على اتجاهات البروتينات في الأغشية (Lomize وآخرون.، 2012). ينتقل الغشاء تقريبًا بين 15 (داخل الخلايا) و + 15 (خارج الخلية)

التركيب والتوزيع والتوطين المفضل لكل حمض أميني. توزيع ترددات الأحماض الأمينية (أعلى) ومجموعات المخلفات (انظر أسفل الشكل 1 للتعرف على مجموعات المخلفات) في أجهزة الصراف الآلي (أ)، BTM (ب) و GLOB (ج) مجموعات البيانات. تظهر أيضًا المساهمة من المخلفات في داخل البروتين (IN) أو في سطح البروتين (OUT). * يشير إلى الفروق الإحصائية (ص & lt 0.05) بين ترددات IN و OUT في اختبار χ2 لملاءمة الجودة مع تصحيحات Bonferroni. (د) تسلسل الشعارات لتكوين البقايا على طول حلزونات TM لمجموعة بيانات ATM. تم إنشاء الصورة باستخدام WebLogo (Crooks وآخرون.، 2004). لكل حلزون ، يعتمد مركز الغشاء (المحدد عند 0 Å) على اتجاهات البروتينات في الأغشية (Lomize وآخرون.، 2012). ينتقل الغشاء تقريبًا بين 15 (داخل الخلايا) و + 15 (خارج الخلية)

3.2.1 المخلفات الأليفاتية

البقايا الأليفاتية هي الأكثر شيوعًا في حلزونات TM. تمثل نصف العدد الإجمالي للمخلفات وتشارك في ثلثي التفاعلات بين المخلفات في حلزونات TM. يتم توزيعها في كل مكان على طول جزء الغشاء الطارد للماء ، على الرغم من أن الحد الأقصى في مركز الطبقة الثنائية. Leu هو إلى حد بعيد بقايا النجم وله أكبر تردد (16٪) وأكبر مشاركة في التفاعلات بين المخلفات (28٪). على سطح البروتين ، Leu و Ile و Val هي البقايا الأكثر شيوعًا ، مما يشير إلى أن الغشاء يفضل التفاعل مع البقايا المتفرعة. تتفاعل هذه البقايا مع Leu و Ile و Val (لا سيما في تفاعلات Leu-Val و Leu-Leu و Leu-Ile) ، بالإضافة إلى بقايا Phe و Ala الموجودة على سطح البروتين. يتم تمثيل هذه التفاعلات بشكل مفرط وفقًا لترددات المخلفات الفردية. في لب البروتين ، Ala هي المخلفات الأليفاتية الأكثر شيوعًا ، تليها Leu ، وبالتالي فهي تشارك في معظم التفاعلات بين البقايا ، بشكل أساسي مع بقايا الأليفاتية الأخرى (Leu و Ala و Val و Ile) و Phe من خلال inter- تفاعلات السلسلة الجانبية الحلزونية. تقدم Ala أيضًا دورًا مهمًا في التفاعلات بين الحلزونية حيث يمكن لسلسلة جانبية صغيرة أن تخصص سلاسل جانبية كارهة للماء والقطبية بالقرب من العمود الفقري. وبالتالي ، فإن المخلفات الأليفاتية تمثل دورًا مهمًا في التعبئة الحلزونية.

في BTM ، تتعرض البقايا الأليفاتية للطبقة الدهنية الثنائية ، وتشارك في 40٪ من جميع التفاعلات ، من خلال تفاعلات أليفاتية - أليفاتية ومن خلال تفاعلات أليفاتية - عطرية. من النادر وجود بقايا أليفاتية في قلب BTM حيث يمكن لجزيئات الماء الوصول إلى لب البروتين. في GLOB ، تشارك البقايا الأليفاتية في 60٪ من التفاعلات ، بشكل رئيسي من خلال التفاعلات الأليفاتية - الأليفاتية. جوهر بروتينات GLOB غني جدًا بالمخلفات الأليفاتية ، خاصة في بقايا Leu و Ala. على الرغم من أن Leu و Ala لهما ترددات متشابهة ، فإن Leu يشارك في ثلث جميع التفاعلات ، بينما يساهم Ala قليلاً.

3.2.2 المخلفات العطرية

تمثل المخلفات العطرية 15 ٪ من جميع المخلفات في حلزونات TM وتشارك في ما يقرب من 36 ٪ من التفاعلات. على الرغم من التفاعلات العطرية العطرية ، فمن المعروف أنها تساهم في جزء كبير من قوى التثبيت في البروتينات (Goyal وآخرون.، 2017) ، فإن عدد التفاعلات من هذا النوع نادر (حوالي 4٪). في المقابل ، تتفاعل المخلفات العطرية بشكل أساسي مع المخلفات الأليفاتية. Phe هو ثاني أكثر المخلفات شيوعًا على حلزونات TM ، وإلى حد بعيد ، البقايا العطرية الأكثر شيوعًا. توجد بقايا Phe بالتساوي في السطح أو في لب البروتين. إنها تظهر توزيعًا مسطحًا نسبيًا على طول مقطع TM ، على الرغم من وجود ذروة في النهاية خارج الخلية. يتفاعل Phe بشكل أساسي مع Leu في السطح ومع المخلفات الأليفاتية بشكل عام في لب البروتين. في الواقع ، يعتبر Phe-Leu هو التفاعل الأكثر شيوعًا بين المخلفات في حلزونات TM ، حيث يلعب دورًا مهمًا في تعبئة الحلزونات من خلال التفاعلات بين الحلزونات الجانبية الجانبية.تحتوي بقايا Tyr و Trp على ترددات صغيرة ولديها تفضيل ملحوظ لنهايات TM ، وفقًا لدورها في التفاعل مع مجموعات الرأس الدهنية (Baker وآخرون.، 2017 مولر وآخرون.، 2008 von Heijne، 1992) ومع المخلفات القطبية في السطح البيني خارج الخلوي وداخل الخلايا. بينما تفضل مخلفات Tyr لب البروتين ، تظهر بقايا Trp مدفونة بالتساوي في داخل البروتين أو على السطح. يشارك Tyr و Trp في تفاعلات قليلة بين المخلفات ، خاصة مع Leu. ومع ذلك ، يتم تمثيل هذه التفاعلات بشكل مفرط مقارنة بالتفاعلات المتوقعة من ترددات الأحماض الأمينية الفردية.

تمثل المخلفات العطرية 40٪ من إجمالي التفاعلات في BTM ، بشكل رئيسي من خلال Tyr و Trp ، والتي تواجه طبقة ثنائية الدهون وتؤدي التفاعلات العطرية - العطرية والأليفاتية - العطرية. يؤدي Tyr عددًا كبيرًا من التفاعلات ، بشكل رئيسي مع المخلفات القطبية والمشحونة في لب البروتين ومع المخلفات الأليفاتية والعطرية الأخرى في سطح البروتين. توجد المخلفات العطرية القليلة الموجودة في GLOB بشكل أساسي في قلب البروتين.

3.2.3 المخلفات القطبية

تمثل المخلفات القطبية 14٪ من إجمالي عدد المخلفات في مقاطع TM وتشارك في 30٪ من التفاعلات ، والتي تشتمل بشكل أساسي على Ser و Thr. لديهم تفضيل واضح لبروتين القلب وينتشرون في كل مكان على طول اللولب TM. تحدث معظم التفاعلات بين السلسلة الجانبية لـ Ser و Thr وكربونيل العمود الفقري للمخلفات في التشوهات المسببة للانعطاف السابقة (Ballesteros وآخرون.، 2000). وبالتالي ، فإن Ser و Thr لهما دور مهم في التفاعلات داخل الحلزونية. يتم أيضًا تكوين عدد قليل من التفاعلات بين الحلزونية بين مجموعة الميثيلين في السلسلة الجانبية Thr والمخلفات الكارهة للماء أو من خلال الروابط الهيدروجينية الضعيفة C-H ··· O-H بين مجموعات الهيدروكسيل والمخلفات الكارهة للماء (Desiraju ، 2005). على الرغم من أن التفاعلات القطبية والقطبية لها دور مهم في وظيفة البروتينات (مولر وآخرون.، 2008) ، هناك عدد قليل نسبيًا من هذه التفاعلات في حلزونات TM. يُظهر Gln و Asn ترددات صغيرة وبالتالي يشاركون في عدد هامشي من التفاعلات بين المخلفات. يفضلون المظهر الخارجي للبروتين ، بالقرب من مجموعات الرأس الدهنية.

تقدم BTM أعلى نسبة من المخلفات القطبية (حوالي 20٪) مقارنة مع أجهزة الصراف الآلي و GLOB. تتفاعل المخلفات القطبية مع جميع أنواع المخلفات وتقع بشكل أساسي في داخل البروتين حيث يمكن أن تتفاعل مع جزيئات الماء. على الرغم من أن المخلفات القطبية متكررة في GLOB ، إلا أنها تساهم قليلاً في التفاعلات ، حيث توجد هذه البقايا على سطح البروتين وتتفاعل بشكل أساسي مع جزيئات الماء.

3.2.4 Gly و Pro

Gly و Pro هما مشوهان أو قواطع حلزونية معروفة. يفضل Gly أن يكون في داخل البروتين - في الواقع هو ثاني أكثر المخلفات شيوعًا في لب البروتين - وفي الجزء المركزي من حلزونات TM. يسمح عدم وجود سلسلة جانبية بتخصيص السلاسل الجانبية للمخلفات الكارهة للماء المجاورة الضخمة بالقرب من العمود الفقري لها (إيلرز وآخرون.، 2002). تشكل السلسلة الجانبية المجاورة تفاعلات C-H ····· O = C ضعيفة مع العمود الفقري لـ Gly. وبالتالي ، فإن Gly له دور مهم في التفاعلات بين الحلقات بين العمود الفقري والعمود الفقري. Pro موجود على طول TM helix ، على الرغم من تفضيله للمنطقة خارج الخلية. يتفاعل Pro بشكل أساسي مع Leu ، إما في قلب البروتين أو في سطح البروتين. يتم تمثيل التفاعلات المؤيدة للأليفاتية بشكل مفرط مع الأخذ في الاعتبار ترددات المخلفات في حلزونات TM. يلعب Pro دورًا مهمًا في التفاعلات داخل الحلزونية ، حيث يتفاعل سلسلته الجانبية مع العمود الفقري للانعطاف السابق ، كمخلفات Ser و Thr. وبالتالي ، إلى جانب دورها كقاطع حلزوني أو كمحفز لتشويه اللولب (كوردس وآخرون.، 2002) ، يساهم Pro في تثبيت حزم TM من خلال التفاعلات داخل الحلزونية.

في BTM ، يساهم Pro في تفاعلات قليلة جدًا ، بينما يشارك Gly في عدد كبير من التفاعلات مع المخلفات العطرية والطارئة للماء من خلال العمود الفقري. في GLOB ، يكون لكل من Pro و Gly ترددات صغيرة وبالتالي مشاركة قليلة في التفاعلات.

3.2.5 Cys و Met

تُظهر البقايا المحتوية على الكبريت Cys و Met ترددات منخفضة (خاصة Cys) في حلزونات TM وتفضل جوهر البروتين ومركز حلزونات TM (انظر الشكل 2). تتفاعل مخلفات Cys بشكل أساسي مع المخلفات الأليفاتية ، Met و Phe. يتوافق هذا مع حقيقة أن المخلفات المحتوية على الكبريت تشكل تفاعلات قوية مع الأحماض الأمينية الأليفاتية والعطرية (كوردومي وآخرون.، 2013 جوميز تامايو وآخرون.، 2016). تتوافق معظم مسافات تفاعل Cys-Cys مع كونها تفاعلات غير مرتبطة بدلاً من روابط ثاني كبريتيد. يُظهر Met مساهمة مهمة في التفاعلات الشاملة بين المخلفات على الرغم من ترددها المنخفض. في الواقع ، يتم تمثيل التفاعلات التي تنطوي على Met بشكل مفرط مقارنة بالتفاعلات المتوقعة من ترددات الأحماض الأمينية الفردية.

تعد Cys و Met أكثر ندرة في BTM و GLOB وتساهم في القليل من التفاعلات. ليس لديهم تفضيل لكونهم داخل أو خارج.

3.2.6 المخلفات المشحونة

تحتوي مجموعة المخلفات المشحونة افتراضيًا (His و Lys و Arg و Glu و Asp) على أصغر ترددات في مقاطع TM - مجموعها 6٪ فقط - وتشارك في عدد قليل من التفاعلات بين البقايا (حوالي 11٪). تقع بالقرب من نهايات مقاطع TM. يواجه Arg و Lys في الغالب الجزء السيتوبلازمي ، باتباع "القاعدة الداخلية الإيجابية" (Baker وآخرون.، 2017 مولر وآخرون.، 2008 von Heijne ، 1992). على الرغم من المشاركة المنخفضة في التفاعلات بين المخلفات ، فإن التفاعلات القليلة المشحونة يتم تمثيلها بشكل مفرط مقارنة بالتفاعلات المتوقعة من ترددات الأحماض الأمينية الفردية المتوافقة مع دورها المتوقع في وظيفة البروتين (مولر) وآخرون., 2008).

البقايا المشحونة قليلة في BTM ، وهي موجودة بشكل أساسي في لب البروتين حيث تؤدي تفاعلات مع المخلفات المشحونة والقطبية. في المقابل ، فإنها تمثل 40٪ من المخلفات في سطح GLOB ، حيث يمكن أن تتفاعل هذه البقايا مع البيئة المحبة للماء ومع المخلفات المشحونة الأخرى.


التصنيف الفرعي الوظيفي لفئات البروتين عبر الغشاء

بعد تحديد بروتينات الغشاء وفصلها عن البروتينات القابلة للذوبان باستخدام برامج التنبؤ الطوبولوجية الموضحة أعلاه ، يتضمن المستوى الثاني من التصنيف في الشكل 1 تجميع سكان بروتينات الغشاء في فئات وظيفية فردية ، وللتحديد المستقبلي لوظيفة الجينات المميزة. تم الإبلاغ عن عدة طرق لإنجاز هذه المهمة ، والتي تم تلخيصها في الجدول 3 والمخططات المرئية في الشكل 2.

كما هو الحال مع العديد من خوارزميات التنبؤ الطوبولوجي ، غالبًا ما تتطلب هذه الطرق تلخيص تسلسل الأحماض الأمينية بطريقة كمية لمقارنة بروتينين. أحد هذه الواصفات التي تم استخدامها بنجاح هو جزء تسلسل البروتين الذي يتكون من كل من الأحماض الأمينية العشرين التي تحدث بشكل طبيعي ، وهو متجه بطول عشرين يصل إلى واحد ويطلق عليه اسم "تكوين الأحماض الأمينية" 56،57. الحدس وراء هذا الواصف هو أن فئات متميزة من بروتينات الغشاء لها تحيز لتشمل أحماض أمينية معينة بتردد أكبر بسبب المتطلبات الهيكلية أو القيود المفروضة على وظيفتها. تم أيضًا اقتراح تحسينات على واصف تكوين الأحماض الأمينية ، مثل استخدام العدد غير الطبيعي من الأحماض الأمينية العشرين في تسلسل البروتين ، وهي طريقة تم الإبلاغ عنها لتكون أكثر فعالية لأنها تلتقط أيضًا الاختلافات في الطول المميز لعائلة البروتين 58. وبالمثل ، فإن توسيع تركيبة الأحماض الأمينية الطبيعية إلى طول متجه ستين وعشرين لتكوين البروتين الكامل ، وعشرين عنصرًا لتكوين الأحماض الأمينية لقطاعات الغشاء وغير الغشائية - قد سمح أيضًا بتمييز أفضل 59. مثل تكوين الأحماض الأمينية ، تم أيضًا استخدام ترددات ثنائي الببتيد بنجاح كواصفات لتمييز بروتينات الغشاء من فئات مختلفة 56،57،60. تم أيضًا استخدام PSSM المذكور سابقًا والمشتق من Position-Specific Iterative BLAST (PSI BLAST) ، والذي يقيس احتمال الاستبدال من المرصودة إلى حمض أميني بديل في موضع معين بناءً على أنماط الاستبدال بين البروتين وجيرانه المتماثلون. وجد أن لديه حساسية عالية كواصف 61. وبشكل أكثر تجريدًا ، تم أيضًا استخدام الواصفات العددية لطاقة الطي في النماذج التنبؤية 61.

مثلما تتنوع واصفات المدخلات لهذه الخوارزميات ، كذلك أنواع التنبؤات الوظيفية التي تم إنتاجها في هذه الدراسات. تم استخدام عدة طرق للتنبؤ بعضوية عائلة أحد الجينات ، مثل تصنيف القنوات والناقلات والناقلات من بعضها البعض 58. بمزيد من التفصيل ، تم استخدام هذه الطرق أيضًا للتنبؤ بركيزة البروتين ، مثل أيونات المعادن المختلفة للقنوات أو البروتين / الأحماض النووية للناقلات 62. تم استهداف التنبؤات أيضًا للمعلمات الوظيفية الخاصة بفئات معينة من بروتينات الغشاء. على سبيل المثال ، تم استخدام تسلسل الأحماض الأمينية للتنبؤ بإمكانية التنشيط نصف القصوى للقنوات ذات الجهد الكهربائي 63 ، والتمييز بين القنوات بناءً على المعلمات الفيزيولوجية الكهربية 64 ، أو تحديد القنوات التي قد تكون بمثابة أهداف علاجية واعدة 65.

تعتمد هذه الطرق الموصوفة سابقًا ، في جوهرها ، على قرب بروتين الاستعلام من مجاورة البروتينات المعروفة في مساحة الواصف المستخدم. تم اقتراح مزيد من التحسينات ، حيث يمكن دمج قياس القرب هذا مع ميزات أخرى مثل مصطلحات علم الوجود الجيني التي تصف العمليات البيولوجية ، والوظائف الجزيئية ، والتوطين دون الخلوي للبروتين 66 ، ووجود عائلات البروتين المرتبطة بالفئة (Pfam) المجالات 67 ، أو عدد مجالات الغشاء المتوقعة 68. يمكن بعد ذلك استخدام التركيبة الناتجة من معلومات التسلسل المشروحة والأولية في خوارزمية تنبؤ مثل SVM 68 التي تمت مناقشتها سابقًا. في الواقع ، فإن قدرة ملفات تعريف الأحماض الأمينية على العمل كميزات ذات صلة لتحديد البروتينات ذات الصلة وظيفيًا قد تشير إلى أن العائلات تشترك في أشكال محددة ، كما تم تحديد أجزاء وزخارف هيكلية محددة في الدراسات ذات الصلة 69،70.

بتوسيع هذه التنبؤات بناءً على بنية ثنائية الأبعاد مرتبطة بالتصنيفات أو المعلمات الوظيفية ، تم أيضًا تطوير طرق لاستنتاج الوظيفة مباشرة بناءً على التشكل ثلاثي الأبعاد. على سبيل المثال ، يستخدم برنامج SLITHER محاكاة النمذجة الجزيئية للتنبؤ بما إذا كان جزيء الركيزة المفترض قد يتخلل التجاويف أو القنوات في بنية البروتين 71. في الحالات التي لا يتم فيها التحقق من وجود قناة في البروتين ، يمكن استخدام برنامج MolAxis للتنبؤ بما إذا كانت موجودة باستخدام الهندسة الحسابية 72. من الواضح أن كلتا الطريقتين تتطلبان إحداثيات بروتينية ثلاثية الأبعاد غير متوفرة تجريبيًا لمعظم القنوات أو بروتينات الغشاء الأخرى ، ولكن يمكن دمجها مع تنبؤات بنية ثلاثية الأبعاد قائمة على التماثل الموصوفة في القسم السابق لتوليد تنبؤات وظيفية للهياكل ثلاثية الأبعاد المستنبطة .

ومن التنبؤات الوظيفية ذات الصلة تحديد الترابط الطبيعي أو الركيزة الأيونية أو شريك تفاعل البروتين للبروتينات الجديدة. في الواقع ، الأمثلة التي تسلط الضوء على التحدي المتمثل في إزالة العقدة من عدد كبير من سبعة مستقبلات بروتين عبر الغشاء ، حيث يظل شريك (شركاء) الربط الطبيعي لبعض مستقبلات الغشاء ذات الخصائص الجيدة مثل BRS-3 غير معروف 73. على الرغم من عدم تطويره بشكل خاص لتحديد تفاعلات الببتيد - المستقبلات في السيليكو، تم وصف تنبؤات واسعة النطاق لتفاعلات البروتين البروتين باستخدام معلومات ثنائية وثلاثية الأبعاد 74،75،76. من المعقول ، يمكن استخدام هذه الخوارزميات لتحديد التفاعلات الجديدة بين روابط الببتيد ومجموعة فرعية من مستقبلات ربط الببتيد. استفاد تحديد المعلومات الحيوية المباشرة للروابط مثل سلائف الببتيد العصبي من زيادة توافر البيانات البروتينية والنيوكليوتيدية على مستوى الجينوم ، كما يتضح من التنبؤ الحسابي لأكثر من 200 ببتيد عصبي جديد في نحل العسل أبيس ميليفيرا، تم التحقق من صحة 100 منها باستخدام peptidomics 77. الدراسات ذات الصلة لخنفساء الطحين الأحمر تريبوليوم كاستانيوم استخدموا تحليل التماثل للتحقق من صحة 30/41 جينات الببتيد العصبي المتوقعة باستخدام بيانات قياس الطيف الكتلي ، وترميز 71 ببتيدًا 78. نظرًا لدقة التنبؤات في هذه الدراسات باستخدام مجموعات بيانات الجينوميات الكبيرة ، فإننا نتوقع أن توفر هذه الأساليب والمعلومات مجموعة واعدة من الروابط الجديدة المحتملة التي يمكن فحصها في فحوصات وظيفية ضد مستقبلات ربط الببتيد المفترضة.


دور عوامل البروتين الأخرى

لا يمكن للتفاعلات بين مجالات TM أن تفسر كيف يمكن تصنيع بروتينين لهما هياكل أولية متطابقة ويستخدمان نفس آلية النقل الأساسية في اتجاهين مختلفين. توجد العديد من البروتينات ، بما في ذلك بروتين البريون (PrP) ، والدكتين ، وبروتين المايلين البروتيني (PLP) ، ومنظم التوصيل الغشائي للتليف الكيسي (CFTR) في أشكال طوبولوجية متعددة (Lopez et al. ، 1990 Dunlop et al. ، 1995 Hegde et al. .، 1998b Wahle and Stoffel، 1998). على الرغم من أن السلسلة الناشئة قد تصل إلى أحد مسارات التحويل العديدة المتاحة ، فقد أظهرت دراسات PrP أن هذا التوزيع يمكن تغييره في كل من رابطة الدول المستقلة وعبرها.

يمكن أن تلعب تفاعلات البروتينات دورًا في كل من تكامل مجال TM والتعرف على STE. يمكن تصنيع PRP بثلاثة أشكال طوبولوجية مختلفة: Ntm PrP ، وهو بروتين غشائي من النوع الأول يكون فيه الطرف N في التجويف Ctm PrP ، وهو بروتين غشائي من النوع الثاني يكون فيه الطرف C في التجويف وشكل إفرازي يسمى ثانية PRP. في المختبر ، في حالة عدم وجود نشاط عامل التبعي (TRAF) ، يتم تصنيع PrP حصريًا على شكل Ctm PrP (Hegde et al. ، 1998b) ، مما يتسبب في حدوث تنكس عصبي في الفئران والبشر عند تصنيعه في الجسم الحي (Hegde et al. ، 1998 أ). لا يُعرف الكثير عن TrAF ، ولكن ربما ينظم كيف ومتى تتفاعل عوامل أخرى ، مثل TRAM ، مع PRP وربما مع العديد من البروتينات الأخرى. اقترحت الدراسات المبكرة أن أحداث التعرف بوساطة المستقبل تحدث أثناء بدء الإزاحة وإيقافها (Mize et al. ، 1986) ، وهو ما يتوافق مع التحديد اللاحق لـ STEs (Yost et al. ، 1990). في الآونة الأخيرة ، حددت دراسات التشابك لتسلسل IgM STE نوعين من بروتينات الغشاء تشارك في التعرف على STE أو وظيفتها (Falcone et al. ، 1999). سيكون توصيف مستقبلات STE هذه إحدى الخطوات التالية نحو فهم كيفية تنظيم التكامل.

يبدو أيضًا أن نشاط المرافق له دور في التكامل. يُقترح عامل بروتين واحد على الأقل في غشاء ER ليكون مسؤولاً عن التخليق الحيوي المناسب لمكون تقاطع الفجوة connexin. في التوليف في المختبر أو في الجسم الحي ، ينتج عن الإفراط في التعبير عن connexin إنتاج جزيئات مشقوقة بشكل شاذ لأن ببتيداز الإشارة يخطئ في مجال TM الأول لببتيد الإشارة. يُعتقد أن الانقسام في مجال TM يتم منعه بواسطة مرافق غير محدد في الغشاء ، والذي يتعرف على السلسلة الوليدة ويمنع وصول ببتيداز الإشارة. في المختبر ، قد يكون هذا الكفيل غائبًا أو غير وظيفي (Falk and Gilula ، 1998).

يمكن أن يؤثر التعديل المهني المشترك للسلاسل الناشئة أيضًا على التخليق الحيوي. يرتبط Oligosaccharyl transferase (OST) بالسلاسل الوليدة لـ translocon و glycosylates عندما تظهر في ER. للنظر في التأثيرات المحتملة للارتباط بالجليكوزيل على اتجاه مجال TM ، أنشأ Goder وآخرون (Goder et al. ، 1999) بروتينًا خيمريًا يمكن تصنيعه في أي من شكلين طوبولوجيين. عندما صمموا مواقع الارتباط بالجليكوزيل ، وجدوا أن إعادة توجيه مجال الغشاء في الترانكونون تم منعه عن طريق الارتباط بالجليكوزيل في حلقة TM lumenal. تشير هذه النتائج إلى أن تنظيم الارتباط بالجليكوزيل للبروتينات الأصلية يمكن أن يتحكم في طي البروتينات وتوجيهها وفقًا لاحتياجات الخلية.

من المحتمل أن تؤثر تفاعلات البروتين الموصوفة أعلاه على التخليق الحيوي للعديد من بروتينات الغشاء المختلفة. تؤثر تفاعلات البروتين الخاصة بالركيزة أيضًا على التخليق الحيوي. في الغشاء ، كما هو الحال في العصارة الخلوية ، ترتبط البروتينات لتشكيل مجمعات وظيفية. كشفت الدراسات التي أجريت على P-type Na + / K + -ATPase أن الإدخال الصحيح لنطاقتي TM للوحدة الفرعية السابعة والثامنة متعددة التصاميم يتطلب ارتباط الوحدة الفرعية bitopic مع الحلقة خارج العصارة الخلوية بين نطاقي TM (Beguin et al. . ، 1998). عندما تواجه الوحدة الفرعية المنطقة المناسبة للوحدة الفرعية α ، يبدو أنها تحفز تغييرًا توافقيًا يعزز الطي والتكامل المناسبين لمجالات TM. قد تمنع التفاعلات العابرة المحددة التي تسهل التكوين المناسب لمجمعات البروتين الغشائية السلسلة الوليدة من تكوين ارتباطات غير مرغوب فيها أو ضارة مع نفسها أو مع البروتينات الأخرى.

لقد بدأنا في فهم المزيد عن البروتينات التي تؤثر على التخليق الحيوي لبروتين الغشاء ، ولكن لا يزال هناك الكثير لنتعلمه. سيؤدي توصيف كل من مستقبلات TrAFs و STE إلى تحسين فهمنا لآلية تكامل مجال الغشاء ، وكذلك الأمثلة الإضافية للتفاعلات الخاصة بالركيزة. سيمكننا تحديد المرافقة المشاركة في التخليق الحيوي للكونيكسين من معرفة كيفية عمل مرافقي الغشاء. أخيرًا ، سيوضح اكتشاف البروتينات التي تستخدم الارتباط بالجليكوزيل للتحكم في التوجه في الجسم الحي طرقًا أخرى يمكن من خلالها تنظيم التخليق الحيوي.


هل نفقد حالة القلة القلة الديناميكية؟ كيف تدرس ديمر متماثل ومرن؟

السيطرة على ديمر ضعيف

من المحتمل أن يكون العدد المنخفض من هياكل TMD المتجانسة المتوفرة حاليًا من SPTMR انعكاسًا للتحديات المرتبطة بالدراسات الهيكلية لهذه الثنائيات المتماثلة والمرنة. من المفترض أن تكون المرونة التوافقية العالية والتقارب المتواضع في متجانسات TMD شرطًا أساسيًا لقدرتهم المتوقعة على التبديل بين المطابقات هذه الخصائص ، ولكن أيضًا تتحدى الدراسات الهيكلية لثنائيات SPTMR-TMD بشكل واضح. كما تمت مناقشته ، يبدو أن الجودة الإجمالية للهياكل المتاحة محدودة ، بالإضافة إلى أن حالة القلة القولية للبروتين ليست دائمًا محددة بوضوح. تم تأكيد الحالة المتجانسة لمعظم أنظمة TMD بشكل أساسي في ظل الظروف المطبقة من خلال الحصول على NOE بين الحلقات [15 ، 23 ، 58-63 ، 65 ، 66 ، 69 ، 71 ، 72] ، في بعض الأحيان بالاقتران مع تجارب الارتباط المتبادل [ 64] أو مع الكشف عن تغيرات الحجم المقدرة من معدلات استرخاء العمود الفقري [61 ، 62 ، 69] أو التنبيذ الفائق [70]. يفضل مقارنة NOEs بين الحلويات التي تم الحصول عليها في التجارب القائمة على المرشح مع الأطياف المرجعية الخلفية للبروتين في غياب البروتين غير المصنف لتجنب التفسير الخاطئ للقمم القوية داخل الجزيئية التي تتسرب عبر المرشح بسبب وضع العلامات على النظائر غير الكاملة [50] ، ولكن نادرًا ما يكون واضحًا إذا تم الحصول عليها. في الدراسات الهيكلية لأجهزة TMD الأحادية ، لا يُظهر دائمًا أن TMD أحادي في الواقع في ظل الظروف المطبقة.من المحتمل أن يكون هذا النقص في تقييم حالة قلة القسيمات نتيجة للمضاعفات التي أدخلها غرسها في محاكاة الغشاء ، مما يجعل تقديرات الحجم الكلاسيكية تعتمد على مجهولين (مدى قلة قلة البروتين وحجم تقليد الغشاء). يعد اكتشاف NOEs بين الحلقات ، عند استخدامه بشكل صحيح ، مقياسًا موثوقًا لعدد كبير من الديمر. ومع ذلك ، فإن NOEs بين الأنواع هي قياسات ثقيلة الموارد وغير مناسبة لتقييم مجموعات كبيرة من الظروف ولا يمكن اكتسابها بسهولة ، إن أمكن ، على بروتينات متفاعلة بشكل عابر [120]. علاوة على ذلك ، فهي ليست مناسبة لتأكيد عدم وجود قلة قليلة لدراسات الحالة الأحادية. تتمثل الإستراتيجية المحتملة في استخدام العلامات المغناطيسية [48] ، والتي قد يتطلب تنفيذها مع ذلك معرفة مسبقة بموقع dimerization ، وتوليد سلسلة من المسوخ ، بالإضافة إلى تحديات تقنية إضافية مرتبطة باستخدام العلامات الكارهة للماء في السياق بيئة تحاكي الغشاء. وبالتالي ، فإن تطوير طرق عالية الإنتاجية لتحديد موثوق للحالة القلة للقليل من TMDs المدمجة في micelle في ظل مجموعة كبيرة من الظروف المناسبة للرنين المغناطيسي النووي أمر ضروري لتطوير المجال. يتمثل أحد الأسباب الواعدة في التطوير الأخير لمقياس الطيف الكتلي الأصلي على بروتينات الغشاء ، مما يسمح باكتساب الأطياف على مجمعات البروتين الغشائي السليمة المضمنة في المذيلات [125]. ومع ذلك ، لا تزال هذه الطرق غير كمية كافية لتحديد مدى قلة القلة.

يتمثل أحد التحديات الخاصة في تثبيت أوليغومرات بروتين الغشاء في مقلدات الأغشية غير الأصلية. لقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الطبقة الدهنية الثنائية قد تشارك في ارتباطات TMD من خلال تأثيرات مستقلة عن التسلسل مثل سمك الغشاء والشحنة [126 ، 127]. علاوة على ذلك ، تم اقتراح التأثيرات المعتمدة على التسلسل التي تتوسط ارتباطًا شحميًا محددًا مع حلزونات TMD للعب أدوارًا مهمة في تنظيم توازن المونومر والثنائي ، عن طريق مواجهة وتقوية dimerization [128]. لا تتم محاكاة هذه التأثيرات بشكل طبيعي بشكل جيد في محاكاة الغشاء التي تسمح بالدراسات الهيكلية عن طريق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي لحالة المحلول ، مما يؤدي إلى زعزعة استقرار متجانسات TMD بشكل أكبر. أفادت العديد من الدراسات أن التوازن بين المونومر والثنائي لبعض اضطرابات المفصل الصدغي الصدغي يمكن معالجته ، وبالتالي دراسته ، من خلال التغييرات في نسبة المنظف إلى البروتين (DP) أو نسبة الدهون إلى البروتين (LP) ، كما أفاد فيشر لأول مرة. وآخرون. [129] في GpA-TMD. هذا مشابه بشكل أساسي للنهج الشائع المتمثل في تخفيف معقد البروتين بهدف دفع التوازن نحو تشكيل المونومر للسماح بتحديد ثابت تفككه. بالإضافة إلى GpA ، تم الإبلاغ عن انتقالات المونومر إلى الثنائيات نتيجة للتغيرات في نسبة DP للعديد من TMDs التي تم الإبلاغ عن الهياكل الخاصة بها ، على سبيل المثال ، أجهزة القياس المتجانسة لـ FGFR3 و VEGFR و ErbB1-4 و APP و TLR3 [23 ، 59-63 ، 69 ، 71 ، 130].

يعد التحليل الطيفي لحالة الحل بالرنين المغناطيسي النووي أداة قوية لدراسة انتقالات المونومر إلى الثنائيات كنتيجة للتغيرات في ، على سبيل المثال ، نسبة DP ، مما يوفر كشف ورسم خرائط على مستوى المخلفات لتشكيل وتفكك معقدات تقارب منخفضة إلى متوسطة ، على سبيل المثال ، المتجانسات ، فضلا عن توفير المعلومات الهيكلية. حتى في الحالات التي تحدث فيها حالات قليلة القسيمات في وقت واحد ، يمكن استخراج البيانات في ظل ظروف معينة وتخصيصها لكل حالة. تم تطوير منهجيات لاستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي لحالة المحلول للتحقيق في قلة القلة في TMD استنادًا إلى معالجة نسبة DP أو LP [130 ، 131] ومع ذلك ، فقد تم تطوير طريقة عالية الإنتاجية لتأكيد أن تغيرات التحول الكيميائي الملاحظة تنبع من التغيرات في حالات قليلة القسيمات لا يزال مرغوبًا فيه. يتمثل العيب الرئيسي أيضًا في أن تركيزات المنظف المطبقة على دراسات الرنين المغناطيسي النووي لها حدود عليا وسفلية. الحد الأعلى ناتج عن زيادة في لزوجة العينة ، وبالتالي تباطؤ في التقلب الجزيئي ، مما يؤدي إلى توسيع الخط [132] ، مع حد التركيز الدقيق الذي يعتمد على طبيعة المنظف والظروف التجريبية. ينشأ الحد الأدنى لأنه من الصعب تحليل البيانات التي تم الحصول عليها بشكل صحيح مع تركيزات المنظفات أقل من تركيز المزيل الحرج (CMC) للمنظف ، حيث إن طبيعة مذيلات البروتين / المنظف في ظل هذه الظروف غير مفهومة جيدًا. وبالتالي ، يمكن فقط تفسير الأنظمة التي تخضع لتحولات كاملة بين المونومر والدايمر ضمن نطاق المنظف المطبق. علاوة على ذلك ، باستثناء APP-TMD في مذيلات LMPG [130] ، فإن غالبية أنظمة المنظفات TMD التي تمت دراستها حتى الآن تظهر تبادلًا بطيئًا على النطاق الزمني للرنين المغناطيسي النووي للانتقال بين المونومر وثنائي المونومر. وبالتالي ، فإن منهجيات الرنين المغناطيسي النووي للدراسة الكمية للأنظمة في التبادل السريع لا تزال مفقودة.

دراسات الرنين المغناطيسي النووي (NMR) لحالة الحل للانتقال بين مونومر ثنائي القطب (TMD)

يعد تحديد حركية التحولات بين المونومر والثنائي في مذيب المنظف حالة معقدة نوعًا ما ، حيث تكون العوامل التي يفرضها نظام المذيب ، مثل CMC ، وخصائص ومشاركة المنظف ، بالإضافة إلى اصطدامات micellar من العوامل المساهمة المحتملة في السلوك المرصود . تم اقتراح العديد من النماذج للمساعدة في اشتقاق الشكليات لوصف قلة القلة لـ TMDs أحادية المرور في مثل هذه الأنظمة: نموذج المذيب المستمر [133 ، 134] ، ونموذج إطلاق المنظفات [129 ، 134] ، ونموذج المذيب الميسيلار [131]. في جوهرها ، يفترض نموذج المذيب المستمر أن المنظف يعمل كمذيب في عملية dimerization ، أي أن dimerization في مذيب micellar يتصرف بشكل مشابه إلى dimerization في الماء أو طبقة ثنائية الدهون. هذا الافتراض قابل للتطبيق بشكل أساسي عندما يحدث الانتقال بين المونومر والدايمر داخل نفس الميلي (على سبيل المثال ، عند انخفاض نسبة DP). في نموذج تحرير المنظفات ، لا يتم التعامل مع المنظف كمذيب ولكن كمشارك في عملية dimerization ، وهو وصف وجد أنه أفضل قابلية للتطبيق عند نسبة DP عالية وعلى ثنائيات قوية نسبيًا. أخيرًا ، يعتمد نموذج مذيب micellar على افتراض أن التباين والتفكك يحدثان فقط عند تصادم المذيلات وتفسخه ، على التوالي. تنطبق الشكليات المرتبطة فقط عندما تكون اصطدامات الميلي متكررة وتكون معدلات تفكك الثنائيات بطيئة على مقياس الوقت NMR ، وبالتالي تصبح التحولات داخل المذيلة الواحدة مهملة. يمكن الاطلاع على وصف مفصل لجميع النماذج والشكليات لوصف التوازن في المرجع. [131]. إن عدم وجود شكليات أو نموذج واحد قادر على وصف جميع التحولات بين المونومر والدايمر يسلط الضوء على مدى تعقيدها ، ولا يزال هناك الكثير الذي يتعين فهمه. تمت دراسة تجانس APP-TMD على سبيل المثال في كل من مذيلات DPC [71] وفي مذيلات LMPG [130] ، حيث يكون المونومر-dimer في التبادل البطيء على مقياس الوقت NMR في DPC ، ولكن في التبادل السريع في LMPG. أي أن الانتقال بين المونومر والثنائي لـ APP-TMD يناسب نموذج تحرير المنظف ونموذج المذيب المستمر ، اعتمادًا على المنظف بدلاً من الطبيعة الجوهرية لاتحاد TMD. يتماشى هذا مع الملاحظة التي تشير إلى أن حجم ثابت التفكك الثنائي يعتمد على المنظف المطبق [129 ، 134] ، وبالتالي يمكن إثارة مسألة الصلة البيولوجية لمثل هذه التقديرات لحركية التوازن. حتى عندما يتم إجراء هذه القياسات في طبقات ثنائية للدهون ، فإن قوة الارتباطات تختلف اختلافًا كبيرًا مع تركيبة الغشاء [126 ، 127] ، وهو سيناريو قد يعكس الصلة البيولوجية. يمكن القول ، كما اقترح مينيف وآخرون. [131] ، أنه يمكن استخدام هذه التقديرات لمقارنة قوة تكوين ثنائيات TMDs المقاسة في نفس بيئة محاكاة الغشاء. ومع ذلك ، كما ذكرنا ، لا تؤثر المنظفات والدهون المختلفة على بنية واستقرار ووظيفة بروتينات الغشاء بشكل مشابه وهذا التفاعل غير مفهوم حاليًا جيدًا. وبالتالي ، فإن السؤال هو ما إذا كانت بيئة محاكاة الغشاء نفسها تؤثر أيضًا على توازن مختلف لمونومر وثنائي المونومر بشكل مختلف ، وبالتالي تصبح حركيات التوازن المقاسة معادلة بها الكثير من المجاهيل لتقديم أي نتائج ذات مغزى بيولوجيًا. وتجدر الإشارة إلى أن معظم هذه الدراسات أجريت على GpA-TMD فقط ، والتي تعتبر عمومًا لتشكيل جهاز homodimer مستقر للغاية [135] ، ويفترض أيضًا أنه أكثر تحملاً لظروف متفاوتة.

فيما يتعلق بالمعرفة الهيكلية للدقة الذرية حول الانتقال بين المونومر والدايمر ، يتم تمثيل وحدات TMD الخاصة بكل من ErbB1 و ErbB2 و APP بواسطة هياكل كل من المونومر والمحاكم المتماثل ، وفي حالة ErbB2 ، لا ينشأ المونومر والدايمر من نفس النوع. بالإضافة إلى ذلك ، كما تمت مناقشته ، يوجد جدل حول هياكل ErbB1-TMD ، في حين أن خصائص APP-TMD غير واضحة بسبب الهياكل المتعددة التي تمثل APP-TMD الأحادي والثنائي. وبالتالي ، لا يتوفر سوى القليل من المعرفة المباشرة حول تفاصيل التحول الهيكلي لـ TMDs عند الانتقال من المونومر إلى ثنائي الأبعاد. ومع ذلك ، فإن حفنة من TMDs الأحادية الحلزونية توضح بوضوح أن تكوين البنية الثانوية غير مفصول عن قلة القلة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن اللولب ErbB1-TMD α-helix قد تم تمديده عند المعالجة المتجانسة [62].


الشد الخلوي

Tensegrity هو مبدأ بناء تم وصفه لأول مرة من قبل المهندس المعماري R. يعرّف فولر أنظمة الشد على أنها هياكل تثبت شكلها عن طريق التوتر المستمر أو "سلامة الأبعاد" بدلاً من الضغط المستمر (على سبيل المثال كما هو مستخدم في قوس حجري). يظهر هذا بوضوح في منحوتات Snelson ، التي تتكون من قضبان معزولة من الفولاذ المقاوم للصدأ مثبتة في موضعها ومعلقة في الفراغ بواسطة كبلات عالية التوتر (الشكل 1 أ). أدت البساطة اللافتة للنظر لهذه المنحوتات إلى وصف معمارية الشد على أنها شبكة متوترة من العناصر الهيكلية التي تقاوم تشويه الشكل وتثبت ذاتيًا من خلال دمج عناصر دعم أخرى تقاوم الضغط. هذه المنحوتات والهياكل المماثلة المكونة من دعامات خشبية وخيوط مرنة (الشكل 1 ب) توضح بشكل جميل توازن القوة الأساسي ، والذي يعتمد على الضغط المحلي والتوتر المستمر (الشكل 2 أ) المسؤول عن ثباتها. ومع ذلك ، فإن العناصر الصلبة ليست مطلوبة ، لأنه يمكن بناء هياكل مماثلة من نوابض مرنة تختلف ببساطة في مرونتها (الشكل 1 ج).

هياكل الشد. (أ) تاج ثلاثي ، منحوتة شد للفنان كينيث سلسن ، مكونة من قضبان من الفولاذ المقاوم للصدأ وكابلات شد. لاحظ أن هذا الهيكل يتكون من وحدات توتر متعددة مترابطة بقواعد مماثلة. (ب) كرة شد تتكون من ستة دعامات خشبية و 24 خيطًا مطاطيًا أبيض ، والتي تحاكي كيف تغير الخلية شكلها عندما تلتصق بركيزة (Ingber ، 1993b). (ج) نفس تكوين الشد كما في B مبني بالكامل من نوابض ذات مرونة مختلفة.

هياكل الشد. (أ) تاج ثلاثي ، منحوتة توتري للفنان كينيث سلسن ، مكونة من قضبان من الفولاذ المقاوم للصدأ وكابلات شد. لاحظ أن هذا الهيكل يتكون من وحدات توتر متعددة مترابطة بقواعد مماثلة. (ب) كرة شد تتكون من ستة دعامات خشبية و 24 خيطًا مطاطيًا أبيض ، والتي تحاكي كيف تغير الخلية شكلها عندما تلتصق بركيزة (Ingber ، 1993b). (ج) نفس تكوين الشد كما في B مبني بالكامل من نوابض ذات مرونة مختلفة.

(أ) عرض تكبير عالي لمنحوتة سليسون مع عينة من الضغط وعناصر التوتر المسمى لتصور توازن قوة الشد على أساس الضغط المحلي والتوتر المستمر. (ب) رسم تخطيطي لتوازن القوة التكميلية بين الخيوط الدقيقة المتوترة (MFs) والخيوط الوسيطة (IFs) والأنابيب الدقيقة المضغوطة (MTs) و ECM في منطقة من صفيف الشد الخلوي. يتم نقل قوى الضغط التي تتحملها الأنابيب الدقيقة (أعلى) إلى التصاقات ECM عندما تتعطل الأنابيب الدقيقة (أسفل) ، مما يزيد من جر الركيزة.

(أ) عرض تكبير عالي لمنحوتة سليسون مع عينة من الضغط وعناصر التوتر المسمى لتصور توازن قوة الشد على أساس الضغط المحلي والتوتر المستمر. (ب) رسم تخطيطي لتوازن القوة التكميلية بين الخيوط الدقيقة المتوترة (MFs) والخيوط الوسيطة (IFs) والأنابيب الدقيقة المضغوطة (MTs) و ECM في منطقة من صفيف الشد الخلوي. يتم نقل قوى الضغط التي تتحملها الأنابيب الدقيقة (أعلى) إلى التصاقات ECM عندما تتعطل الأنابيب الدقيقة (أسفل) ، مما يزيد من جر الركيزة.

وفقًا لتعريف فولر الأكثر عمومية ، يشمل التوتر فئتين هيكليتين عريضتين - الإجهاد المسبق والجيوديسي - اللذان يفشل كلاهما في التصرف ككيان واحد أو الحفاظ على استقرار شكله عند الضغط ميكانيكيًا دون انتقال مستمر للقوى المتوترة (Fuller ، 1961 Fuller ، 1979 Ingber، 1998 Chen and Ingber، 1999). الأولى تثبت مفاصلها في موضعها نتيجة "الإجهاد المسبق" (إجهاد الشد الموجود مسبقًا أو التوتر متساوي القياس) داخل الهيكل (الشكل 1). تقوم الأخيرة بتثليث أعضائها الهيكلية وتوجيهها على طول الجيوديسيا (الحد الأدنى من المسارات) لتقييد الحركة هندسيًا. تقدم أجسادنا مثالاً مألوفًا عن هيكل الشد المسبق الإجهاد: تعمل عظامنا مثل الدعامات لمقاومة شد عضلات الشد والأوتار والأربطة ، ويختلف استقرار الشكل (تصلب) أجسامنا اعتمادًا على النغمة (الإجهاد) في عضلاتنا . تتضمن أمثلة هياكل الشد الجيوديسية قباب فولر الجيوديسية ، وأطر باكي فوليرين القائمة على الكربون (كرات بوكي) ، وإطارات الفضاء رباعية السطوح ، والتي تحظى بشعبية لدى وكالة ناسا لأنها تحافظ على ثباتها في غياب الجاذبية ، وبالتالي ، بدون ضغط مستمر.

يستخدم بعض المحققين الشد للإشارة فقط إلى هياكل "القضبان والكابلات" المُجهدة مسبقًا أو فئات فرعية معينة من هذه (مثل الأشكال غير المقيدة) (Snelson ، 1996 Heidemann et al. ، 2000). منذ أن حدد فولر مصطلح الانكماش ، أستخدم تعريفه الأكثر عمومية هنا. إن وجود أساس هيكلي مشترك لهاتين الفئتين المختلفتين من البنية يدعمه أيضًا العمل الأخير لعالم الرياضيات روبرت كونيلي. لقد طور طريقة مبسطة للغاية لوصف تكوينات الشد المسبق الإجهاد ثم اكتشف أن نفس القواعد الرياضية الأساسية تصف أقرب تعبئة للكرات (Connelly and Back ، 1998) ، والتي تحدد أيضًا الأشكال الجيوديسية المختلفة (فولر ، 1965).

يقترح نموذج الشد الخلوي أن الخلية بأكملها عبارة عن هيكل شد مسبق الإجهاد ، على الرغم من وجود الهياكل الجيوديسية أيضًا في الخلية بمقاييس أصغر حجمًا. في النموذج ، تتحمل الخيوط الدقيقة للهيكل الخلوي والخيوط الوسيطة قوى الشد ، وتتم موازنة هذه القوى بواسطة عناصر هيكلية مترابطة تقاوم الضغط ، وعلى الأخص ، دعامات الأنابيب الدقيقة الداخلية والالتصاق المصفوفة خارج الخلية (الشكل 2 ب). ومع ذلك ، يمكن أن يكون للخيوط الفردية وظائف مزدوجة وبالتالي فهي تتحمل التوتر أو الانضغاط في سياقات هيكلية مختلفة أو بمقاييس أحجام مختلفة (مثل حزم خيوط الأكتين الصلبة تتحمل الضغط في أرجل الخيط). يتم إنشاء الإجهاد المسبق للتوتر الذي يعمل على استقرار الخلية بأكملها بنشاط بواسطة جهاز الأكتوموسين المقلص. تأتي المساهمات السلبية الإضافية لهذا الإجهاد المسبق من انتفاخ الخلية من خلال التصاقات بـ ECM والخلايا الأخرى ، والقوى التناضحية التي تعمل على غشاء الخلية ، والقوى التي تمارسها بلمرة الشعيرات. توفر الخيوط الوسيطة التي تترابط في العديد من النقاط على طول الأنابيب الدقيقة والألياف الدقيقة والسطح النووي صلابة ميكانيكية للخلية من خلال خصائصها المادية وقدرتها على العمل ككابلات معلقة تربط الهيكل الخلوي بالكامل والشبكية النووية. بالإضافة إلى ذلك ، يترابط الهيكل الخلوي الداخلي عند محيط الخلية بشبكة هيكل خلوي قشرية عالية المرونة تقع مباشرة تحت غشاء البلازما. تعتمد كفاءة الاقتران الميكانيكي بين هذه الشبكة الهيكلية الغشائية والشبكة الداخلية للهيكل الخلوي على نوع مركب الالتصاق الجزيئي الذي يتشكل على سطح الخلية. يتم بعد ذلك اختراق الهيكل الخلوي المتكامل بالكامل بواسطة عصارة خلوية لزجة ومحاطة بغشاء سطحي قابل للاختراق بشكل تفاضلي.


امتحان CMB 334 1

تستخدم أنظمة الفلاتر الحديثة عناصر مخبرية بلاستيكية يمكن التخلص منها بدلاً من المرشحات القائمة على الطحالب وتحتوي على غرف علوية / سفلية ومتاحة في مجموعة متنوعة من أحجام المسام.

1.) طبيعة حمض نووي في الفيريون (نموذج بالتيمور ، الأكثر استخدامًا)

2.) تناظر قذيفة البروتين / قفيصة

3.) حضور أ غشاء دهني / مغلف

خلية مقاومة- لا يسمح بدخول الفيروسات

فحص Florescence-Focus- مشابه لمقايسة اللويحات ، باستثناء جسم مضاد للفيروس يضاف إلى جانب جسم مضاد لمؤشر الفلورسنت الثاني الذي يرتبط بالجسم المضاد الأول من أجل مراقبة عيار الفيروس مثل & quotوحدات تشكيل تركيز الفلورسنت / مل& مثل.

فحص المراكز المعدية- مشابه لمقايسة البلاك ، إلا أنه يبدأ بعدد معروف من الخلايا المصابة ويستخدم لقياس نسبة الخلايا المصابة في الثقافات المصابة بشكل مستمر.

فحص التحول- مفيد للفيروسات القهقرية التي لا تشكل لويحات ، فهو يقيس عدد & quotpiles & quot أو البؤر هذا الشكل بسبب فقدان الخلايا المصابة لتثبيط الاتصال بها مما يسمح لها بتكوين طبقة أحادية عادية. هذا يقاس في وحدات تشكيل البؤرة / مل.


شاهد الفيديو: السر وراء جذب الهدف فك التعلق به عمارة (أغسطس 2022).