معلومة

الفرق بين micro RNA و RNA قصير التداخل ونظام CRISPR Cas 9؟

الفرق بين micro RNA و RNA قصير التداخل ونظام CRISPR Cas 9؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد قرأت هذا المقال https://www.quantamagazine.org/20150206-crispr-dna-editor-bacteria/ وأنا في حيرة قليلاً من سبب اعتبار نظام CRISPR / Cas 9 ثوريًا للغاية. يبدو أنه نفس الشيء الذي يقوم به الرنا الميكروي والحمض النووي الريبي المتداخل القصير - يشق خيوط الرنا المرسال المركبة عن طريق الارتباط بالجزء التكميلي من خيط الرنا المرسال ، وتتحد الإنزيمات المقيدة مع هذا الرنا وتشقّه. لا أرى كيف يكون نظام كريسبر مختلفًا أو أفضل ...

شكرا لكم مقدما :)

تحرير: أيضًا ، هل يعرف أي شخص ما إذا كان Cas 9 يقطع كل من خيوط الحمض النووي في نفس المكان ، أو ما إذا كان يترك "أطرافًا لزجة"؟ شكرا لك.


يستخدم نظام CRISPR Cas 9 لإدخال الإدراج أو الحذف في تسلسل جيني وليس mRNA.

https://www.addgene.org/CRISPR/guide/


الملخص

يتكرر المتناظر القصير العنقودي بفواصل زمنية منتظمة ، ويختصر بـ CRISPR ، ويعمل كنظام دفاع عن النفس لدائيات النوى ، ويكشف عن حمض نووي معين ممرض ، ويتداخل مع وظائف الحمض النووي الخارجي ، ويحميها من الغزاة الأجانب. في السنوات الأخيرة ، اجتذبت تقنية CRISPR اهتمامًا متزايدًا في مجال التشخيص المختبري نظرًا لخصوصية الأليل المتأصلة فيها ، والتي تعد أحد العوامل الحاسمة للتطبيق الناجح لهذه التقنية في تطوير العلاج والتشخيص عالي الدقة. هنا ، تهدف مقالة المراجعة هذه إلى تقديم نظرة عامة على التشخيصات الطبية الحيوية المعتمدة على البروتينات المرتبطة بـ CRISPR-CRISPR ، بما في ذلك الآلية البيولوجية والمواد الحيوية والتطبيقات. تقدم هذه الورقة أولاً بإيجاز تاريخ التطوير والخصائص البيولوجية لنظام CRISPR-Cas ، ثم تلخص حالة التطبيق واتجاه التطوير لنظام CRISPR-Cas في اكتشاف وتحديد مسببات الأمراض المعينة ، وتحديداً عرض احتمالية رائعة في معظم اندلاع فيروس كورونا الجديد (المعروف سابقًا باسم 2019-nCoV). علاوة على ذلك ، يتم تجميع قوتها التشخيصية المحتملة في طفرات الجين الورمي واكتشاف اختلافات النوكليوتيدات الفردية. أخيرًا ، نناقش التحديات والآفاق المستقبلية لمنصات التشخيص القائمة على نظام CRISPR-Cas في الطب الحيوي ، على أمل زيادة إلهام تطوير التشخيصات الطبية الحيوية.


النار ، إيه وآخرون. تدخل وراثي قوي ومحدد بواسطة الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة في أنواع معينة انيقة. طبيعة سجية 391, 806–811 (1998)

البشير ، س.م وآخرون. الازدواجية من 21 نيوكليوتيد RNAs تتوسط في تدخل الحمض النووي الريبي في خلايا الثدييات المستزرعة. طبيعة سجية 411, 494–498 (2001)

Root، D. E.، Hacohen، N.، Hahn، W.C، Lander، E. S. & amp Sabatini، D.M Genome-scale-scale-loss of-of-function screening باستخدام مكتبة lentiviral RNAi. نات. أساليب 3, 715–719 (2006)

جاكسون ، أ. ل. وآخرون. يكشف التنميط التعبير عن تنظيم الجينات خارج الهدف بواسطة RNAi. نات. التكنولوجيا الحيوية. 21, 635–637 (2003)

Tyagi ، S. تصوير توزيع وديناميكيات الحمض النووي الريبي داخل الخلايا في الخلايا الحية. نات. أساليب 6, 331–338 (2009)

شماكوف ، إس وآخرون. تنوع وتطور أنظمة الفئة الثانية CRISPR-Cas. نات. القس ميكروبيول. 15, 169–182 (2017)

شماكوف ، إس وآخرون. الاكتشاف والتوصيف الوظيفي لأنظمة CRISPR-Cas المتنوعة من الفئة 2. مول. زنزانة 60, 385–397 (2015)

أبودية ، و. و. وآخرون. C2c2 عبارة عن مستجيب CRISPR من مكون واحد قابل للبرمجة وموجه من RNA يستهدف RNA. علم 353، aaf5573 (2016)

Gootenberg ، J. S. et al. كشف الحمض النووي باستخدام CRISPR – Cas13a / C2c2. علم 356, 438–442 (2017)

دالمان ، ج. إي وآخرون. خروج المغلوب للجين المتعامد وتنشيطه باستخدام نوكلياز Cas9 النشط تحفيزيًا. نات. التكنولوجيا الحيوية. 33, 1159–1161 (2015)

هتشينسون ، جيه إن وآخرون. تحدد شاشة النصوص النووية اثنين من الحمض النووي الريبي المرتبط غير المشفر المرتبطين بمجالات الربط SC35. علم الجينوم BMC 8, 39 (2007)

إيست سليتسكي ، إيه وآخرون. يتيح نشاطان RNase المتميزان لـ CRISPR-C2c2 معالجة دليل الحمض النووي الريبي واكتشاف الحمض النووي الريبي. طبيعة سجية 538, 270–273 (2016)

زيتشي ، ب. وآخرون. التحرير الجيني المتعدد بواسطة CRISPR – Cpf1 باستخدام صفيف كرنا واحد. نات. التكنولوجيا الحيوية. 35, 31–34 (2017)

سوبرامانيان ، إيه وآخرون. تحليل تخصيب مجموعة الجينات: نهج قائم على المعرفة لتفسير ملامح التعبير على مستوى الجينوم. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 102, 15545–15550 (2005)

راث ، إس وآخرون. يقوم RNase L البشري بضبط التعبير الجيني عن طريق زعزعة الاستقرار الانتقائي للنسخة التي ينظمها الرنا الميكروي. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 112, 15916–15921 (2015)

جروس ، جي جي وآخرون. تحقيقات المؤتلف لتصور البروتينات المشبكية الذاتية في الخلايا العصبية الحية. عصبون 78, 971–985 (2013)

Unsworth، H.، Raguz، S.، Edwards، H.J، Higgins، C.F & amp Yagüe، E. FASEB J. 24, 3370–3380 (2010)

Nelles، D. A. et al. تتبع RNA القابل للبرمجة في الخلايا الحية باستخدام CRISPR / Cas9. زنزانة 165, 488–496 (2016)

توريير ، هـ وآخرون. يجمع نوكلياز إندوريبونوكلياز G3BP المرتبط بـ RasGAP حبيبات الإجهاد. J. خلية بيول. 160, 823–831 (2003).

تافر ، هـ وآخرون. تأثير إمكانية الوصول إلى الموقع المستهدف على تصميم siRNAs الفعالة. نات. التكنولوجيا الحيوية. 26, 578–583 (2008)

مان ، دي جي وآخرون. النواقل المتوافقة مع البوابة للتحليل الوظيفي الجيني عالي الإنتاجية في Switchgrass (بانيكوم فيرجاتوم L.) وأنواع monocot أخرى. التكنولوجيا الحيوية النباتية. ج. 10, 226–236 (2012)

تشانغ ، واي وآخرون. نظام بروتوبلاست عالي الكفاءة للأنسجة الخضراء للأرز للتعبير الجيني العابر ودراسة العمليات ذات الصلة بالضوء / البلاستيدات الخضراء. طرق النبات 7, 30 (2011)

جونج ، جيه وآخرون. مقياس الجينوم CRISPR-Cas9 بالضربة القاضية وفحص تنشيط النسخ. نات. البروتوكولات 12, 828–863 (2017)

Jain، M.، Nijhawan، A.، Tyagi، A.K & amp Khurana، J.P. التحقق من صحة جينات التدبير المنزلي كعنصر تحكم داخلي لدراسة التعبير الجيني في الأرز عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي. بيوتشيم. بيوفيز. الدقة. كومون. 345, 646–651 (2006)

Bernhart، S.H، Hofacker، I.L & amp Stadler، P. F. احتمالات اقتران قاعدة الحمض النووي الريبي المحلية في متواليات كبيرة. المعلوماتية الحيوية 22, 614–615 (2006)

Li ، B. & amp Dewey ، C.N. RSEM: التحديد الكمي الدقيق للنسخة من بيانات RNA-Seq مع أو بدون جينوم مرجعي. المعلوماتية الحيوية BMC 12, 323 (2011)

شيندلين ، جيه وآخرون. فيجي: منصة مفتوحة المصدر لتحليل الصور البيولوجية. نات. أساليب 9, 676–682 (2012)


محتويات

تم اكتشاف بعض من أقدم asRNAs أثناء فحص البروتينات الوظيفية. ومن الأمثلة على ذلك micF asRNA. أثناء توصيف الغشاء الخارجي porin ompC in بكتريا قولونية، بعض الحيوانات المستنسخة من محفز ompC التي تمت ملاحظتها كانت قادرة على قمع التعبير عن غشاء بورين آخر مثل ompF. تم العثور على المنطقة المسؤولة عن وظيفة القمع هذه لتكون موضع 300 زوج أساسي في اتجاه مجرى مروج ompC. هذه المنطقة المكونة من 300 زوج أساسي هي 70 ٪ متجانسة بالتسلسل مع نهاية 5 'من ompF mRNA ، وبالتالي فإن نسخة هذا الموضع المكون من 300 زوج أساسي مكمل لـ ompF mRNA. في وقت لاحق ، تم العثور على هذا النص ، المشار إليه بـ micF ، ليكون بمثابة asRNA لـ ompF وقادر على تقليل تنظيم التعبير عن ompF تحت الضغط عن طريق تشكيل مزدوج باستخدام ompF mRNA. هذا يؤدي إلى تدهور ompF mRNA. [2]

على عكس micF RNA الذي تم اكتشافه عن طريق الصدفة ، تم اكتشاف غالبية asRNAs من خلال عمليات البحث على نطاق الجينوم عن الحمض النووي الريبي التنظيمي الصغير وعن طريق تحليل الترنسكريبتوم. تقليديًا ، تتضمن الخطوة الأولى تنبؤات حسابية تستند إلى بعض الخصائص المعروفة لـ asRNAs. أثناء عمليات البحث الحسابية ، يتم استبعاد مناطق التشفير. يُفضل أثناء التحليل المناطق التي يُتوقع أن تكون قد حافظت على هياكل الحمض النووي الريبي وتعمل كمروّجات يتيمة وأنظمة إنهاء مستقلة. نظرًا لأن عمليات البحث الحسابية تركز على المنطقة بين الجينات ، فمن المحتمل أن يتم تفويت asRNAs التي يتم نسخها من الخيط المعاكس لجين الترميز باستخدام هذه الطريقة. لاكتشاف الحمض النووي الريبي المنسوخ من منطقة التشفير ، يمكن استخدام المصفوفات الدقيقة قليلة النوكليوتيد. في هذه الطريقة ، يمكن استخدام أحد خيوط الجينات المشفرة أو كليهما كمجسات. بالإضافة إلى عمليات البحث الحسابية والمصفوفات الدقيقة ، تم اكتشاف بعض الرنا الريباسي من خلال تسلسل استنساخ (كدنا) وكذلك تعيين عناصر المحفز. [7] على الرغم من أن العديد من النتائج من الأساليب المذكورة أعلاه أدت إلى ظهور الكثير من الحمض الريبي النووي الريبي الممكن ، إلا أن القليل منها فقط ثبت أنها حقيقية من خلال اختبارات وظيفية أخرى. لتقليل عدد النتائج الإيجابية الخاطئة ، ركزت الأساليب الجديدة من السنوات الأخيرة على النسخ الخاص بالخيوط ، و RNAs غير المشفر للكروماتين ودراسات الخلية الواحدة. [1]

بدأت فكرة asRNAs كأهداف للأدوية في عام 1978 عندما وجد Zamecnik و Stephenson قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية لـ RNA الفيروسي لفيروس Rous Scarcoma والذي كان قادرًا على تثبيط تكاثر الفيروس وتخليق البروتين. منذ ذلك الحين ، تم تكريس الكثير من الجهود لتطوير جزيئات الحمض النووي الريبي (asRNAs) كمرشحين للعقاقير. في عام 1998 ، تمت الموافقة على أول عقار أس آر إن إيه ، فوميفيرسن ، من قبل إدارة الغذاء والدواء. تم تطوير Fomivirsen ، وهو 21 زوج قاعدي قليل النوكليوتيد ، لعلاج التهاب الشبكية المضخم للخلايا في مرضى الإيدز. إنه يعمل عن طريق استهداف mRNA المنسوخ للفيروس وبالتالي منع تكاثر الفيروس المضخم للخلايا. على الرغم من إيقاف fomivirsen في عام 2004 بسبب فقدان السوق ، فقد كان بمثابة مثال ناجح وملهم لاستخدام asRNAs كأهداف للأدوية أو مرشحين للعقاقير. [5]

مثال آخر على استخدام asRNA كعامل علاجي هو mipomersen ، الذي تمت الموافقة عليه من قبل FDA في عام 2013. تم تطوير Mipomersen لإدارة مستوى كوليسترول البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) في المرضى الذين يعانون من فرط كوليسترول الدم العائلي متماثل الزيجوت (HoFH) ، وهو أحد نادر وراثي سائد وراثي. بسبب ارتفاع مستوى الكوليسترول الكلي (650-1000 مجم / ديسيلتر) ومستقبل LDL (أعلى من 600 مجم / ديسيلتر) في HoFH ، فإن المرضى الذين يعانون من HoFH لديهم مخاطر عالية للإصابة بأمراض القلب التاجية. نظرًا لأنه وُجد أن البروتين apo-B-100 مطلوب لإنتاج بروتين شحمي منخفض الكثافة جدًا (VLDL) و LDL ، فإن الميبومرسين يكمل الحمض النووي الريبي لـ apo-B-100 ويستهدفه للتحلل المعتمد على RNAse H. في النهاية ، يستطيع الميبوميرسن تقليل مستوى البروتين الدهني منخفض الكثافة. [8]

تم اكتشاف ASRNAs الأولية في بدائيات النوى بما في ذلك البلازميدات والعاثية والبكتيريا. على سبيل المثال ، في البلازميد ColE1 ، يلعب AsRNA المسمى RNA I دورًا مهمًا في تحديد رقم نسخة البلازميد عن طريق التحكم في النسخ المتماثل. يعتمد تكرار ColE1 على نسخ RNA التمهيدي المسمى RNA II. بمجرد نسخ RNA II ، يتم تهجينه إلى قالب DNA الخاص به ثم يتم شق بواسطة RNase H. في وجود AsRNA RNA I ، يشكل RNA I و RNA II مزدوجًا يقدم تغييرًا توافقيًا لـ RNA II. وبالتالي ، لا يمكن تهجين RNA II مع قالب الحمض النووي الخاص به والذي ينتج عنه عدد نسخ منخفض من ColE1. في العاثية P22 ، يساعد AsRNA sar على التنظيم بين الدورة اللايتية والدورة اللايسوجينية من خلال التحكم في تعبير النمل. [9] إلى جانب التعبير عنها في بدائيات النوى ، تم اكتشاف أس آر إن إيه أيضًا في النباتات. المثال الأكثر وصفًا لتنظيم أس آر إن إيه في النباتات هو جين موقع الزهرة C (FLC). يقوم جين FLC في Arabidopsis thaliana بترميز عامل النسخ الذي يمنع التعبير عن مجموعة من الجينات التي تحفز انتقال الأزهار. في البيئة الباردة ، يتم التعبير عن asRNA لجين FLC ، والمشار إليه بـ COOLAIR ، ويمنع التعبير عن FLC عبر تعديل الكروماتين الذي يسمح بالتالي بالإزهار. [10] في خلايا الثدييات ، أحد الأمثلة النموذجية على تنظيم أس آر إن إيه هو تعطيل كروموسوم إكس. يمكن لـ Xist ، وهو asRNA ، تجنيد المركب القمعي متعدد الخلايا 2 (PRC2) الذي ينتج عنه تغاير اللون في الكروموسوم X. [3]

يمكن تصنيف الحمض النووي الريبي المضاد المعنى بطرق مختلفة. فيما يتعلق بالآليات التنظيمية ، يقوم بعض المؤلفين بتجميع الحمض النووي الريبي في تفاعلات RNA-DNA ، وتفاعلات RNA-RNA إما في النواة أو السيتوبلازم وتفاعلات بروتين RNA (اللاجينية). [3] يمكن تصنيف الحمض النووي الريبي المضاد للدلالة حسب نوع المحفزين الذين يبدؤون التعبير عن asRNAs: المروجون المستقلون أو المروجون ثنائيو الاتجاه المشتركون أو المروجون المشفرون. من حيث الطول ، على الرغم من تصنيف asRNA بشكل عام ضمن lncRNAs ، إلا أن هناك جزيئات asRNA قصيرة بطول أقل من 200 زوج أساسي. نظرًا لأنه تم العثور على الآلية التنظيمية لـ asRNAs خاصة بالأنواع ، يمكن أيضًا تصنيف asRNAs حسب الأنواع. [1] إحدى الطرق الشائعة لتصنيف الحمض النووي الريبي هو المكان الذي يتم فيه نسخ الـ asRNA نسبيًا إلى جيناتها المستهدفة: المفعول cis و trans-act.

تحرير التمثيل Cis

يتم نسخ asRNAs التي تعمل برابطة الدول المستقلة من الخيط المعاكس للجين المستهدف في موضع الجين المستهدف. غالبًا ما تظهر درجة عالية أو تكامل تام مع الجين المستهدف. إذا كان asRNA يعمل في رابطة الدول المستقلة ينظم التعبير الجيني عن طريق استهداف mRNA ، فيمكنه فقط استهداف mRNA الفردي. عند التفاعل مع mRNAs المستهدفة ، يمكن لـ asRNAs التي تعمل بنظام cis إما منع ارتباط الريبوسوم أو تجنيد RNAase لتقليل استهداف mRNAs. وبالتالي ، فإن وظيفة هذه الأحماض النووية الريبية التي تعمل بنظام رابطة الدول المستقلة هي قمع ترجمة mRNAs المستهدفة. [2] إلى جانب جزيئات asRNAs التي تعمل في رابطة الدول المستقلة والتي تستهدف mRNAs ، هناك كاتمات وراثية وراثية تعمل بنظام رابطة الدول المستقلة. ثبت أن الحمض النووي الريبي المضاد المعنى يثبط ترجمة مجال LINE1-ORF2 من Entamoeba histolytica. ومع ذلك ، لم يتم تأكيد ما إذا كانت تعمل في رابطة الدول المستقلة أو عبر. [11]

فيما يتعلق بالتعديل الوراثي اللاجيني ، يشير الفعل cis إلى طبيعة هذه الأحماض النووية الريبية التي تنظم التغيرات اللاجينية حول الموقع حيث يتم نسخها. بدلاً من استهداف mRNAs الفردية ، يمكن للمنظمات اللاجينية التي تعمل في رابطة الدول المستقلة تجنيد إنزيمات معدلة للكروماتين يمكن أن تؤثر على كل من مواقع النسخ والجينات المجاورة. [3]

تحرير عبر التمثيل

يتم نسخ asRNAs عبر المفعول من مواضع بعيدة عن جينات الاستهداف. على النقيض من asRNAs التي تعمل في رابطة الدول المستقلة ، فإنها تظهر درجة منخفضة من التكامل مع الجين المستهدف ولكن يمكن أن تكون أطول من asRNAs التي تعمل في رابطة الدول المستقلة. يمكنهم أيضًا استهداف مواقع متعددة. بسبب هذه الخصائص لـ asRNAs المتفاعلة ، فإنها تشكل مجمعات أقل استقرارًا بنصوص الاستهداف الخاصة بها وتتطلب أحيانًا مساعدات من بروتين RNA chaperone مثل Hfq لممارسة وظائفها. نظرًا لتعقيد asRNAs العابرة للتأثير ، فإنها تعتبر حاليًا أهدافًا أقل قابلية للعقاقير. [2]

تحرير الوظيفة

تحرير تنظيم الجينات

تظهر العديد من أمثلة asRNAs التأثير المثبط على بدء النسخ عبر التعديلات اللاجينية.

تحرير مثيلة الحمض النووي

يمكن أن تؤدي مثيلة الحمض النووي إلى تقليل التنظيم على المدى الطويل لجينات معينة. تم العثور على قمع البروتينات الوظيفية عبر مثيلة الحمض النووي المستحث بـ asRNA في العديد من الأمراض البشرية. في فئة من الثلاسيميا ألفا ، وهو نوع من اضطرابات الدم يؤدي إلى انخفاض مستوى الهيموجلوبين مما يؤدي إلى نقص الأكسجين في الأنسجة ، [12] يتم تنظيم جين الهيموغلوبين ألفا 1 (HBA1) عن طريق نسخة غير طبيعية من البروتين المفترض المرتبط بالحمض النووي الريبي Luc7- مثل (LUC71) الذي يعمل بمثابة asRNA لـ HBA1 ويحفز مثيلة مروج HBA1. [1] مثال آخر هو إسكات الجين الكابت للورم p15INK4b ، المعروف أيضًا باسم CDKN2B ، في ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد وسرطان الدم النخاعي الحاد. إن asRNA المسؤول عن هذا التأثير الصامت هو الحمض النووي الريبي المضاد للترميز غير المشفر في موضع الحبر (ANRIL) ، والذي يتم التعبير عنه في نفس الموضع الذي يشفر لـ p15INK4b. [3]

تعديل تعديل هيستون

في الخلايا حقيقية النواة ، يتم تعبئة الحمض النووي بإحكام بواسطة الهستونات. يمكن أن يؤدي التعديل على الهستونات إلى تغيير التفاعلات مع الحمض النووي الذي يمكن أن يؤدي إلى مزيد من التغييرات في التعبير الجيني. النتائج البيولوجية لميثيل هيستون تعتمد على السياق. بشكل عام ، تؤدي مثيلة الهيستون إلى قمع الجينات ولكن يمكن أيضًا تحقيق تنشيط الجين. [13] وقد أظهرت الأدلة أنه يمكن تحفيز مثيلة الهيستون بواسطة asRNAs. على سبيل المثال ، يمكن لـ ANRIL ، بالإضافة إلى القدرة على تحفيز مثيلة الحمض النووي ، أيضًا قمع الجين المجاور لـ CDKN2B ، CDKN2A ، عن طريق تجنيد المركب القمعي متعدد الخلايا 2 (PRC2) الذي يؤدي إلى مثيلة الهيستون (H3K27me). مثال كلاسيكي آخر هو تعطيل كروموسوم X بواسطة XIST. [1]

يعد التعديل الوراثي اللاجيني المستحث بواسطة ANRIL مثالاً على التنظيم اللاجيني الذي يعمل برابطة الدول المستقلة. [3] بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون تعديل الكروماتين الناجم عن الحمض النووي الريبي المضاد للتردد عبر المفعول. على سبيل المثال ، في الثدييات ، يتم نسخ asRNA HOTAIR من موقع homeobox C (HOXC) ولكنه يجند PRC2 إلى HOXD الذي يودع H3K27 ويصمت HOXD. يتم التعبير عن HOTAIR بشكل كبير في أورام الثدي الأولية. [1]

تعديل تنظيم النسخ المشترك

يمكن للوائح الوراثة اللاجينية مثل مثيلة الحمض النووي ومثيل هيستون أن تثبط التعبير الجيني عن طريق تثبيط بدء النسخ. ومع ذلك ، في بعض الأحيان ، يمكن تحقيق قمع الجينات عن طريق الإنهاء المبكر أو إبطاء عملية النسخ. يمكن أن تشارك AsRNAs في هذا المستوى من تنظيم الجينات. على سبيل المثال ، في الخلايا البكتيرية أو حقيقية النواة حيث توجد بوليمرات الحمض النووي الريبي المعقدة ، يمكن أن يؤدي النسخ ثنائي الاتجاه في نفس المكان إلى تصادم البلمرة وينتج عنه إنهاء النسخ. حتى عندما يكون اصطدام البوليميراز غير محتمل أثناء النسخ الضعيف ، يمكن أن يحدث توقف مؤقت للبوليميراز أيضًا مما يمنع الاستطالة ويؤدي إلى كبت الجينات. أحد الأمثلة على ذلك هو قمع جين IME4 بواسطة asRNA RME2. هناك طريقة أخرى للتأثير على النسخ المشترك وهي منع التضفير. أحد الأمثلة الكلاسيكية في الإنسان هو جين E-box المرتبط بإصبع الزنك (ZEB2) والذي يشفر E-cadherin ، وهو مثبط نسخي. تتطلب الترجمة الفعالة لـ ZEB2 mRNA وجود موقع دخول ريبوسوم داخلي (IRES) في intron من mRNA في نهاية 5 '. مع التعبير عن asRNA لـ ZEB2 ، يمكنه إخفاء موقع الربط والحفاظ على IRES في mRNA مما ينتج عنه تخليق فعال لـ E-cadherin. أخيرًا ، اعتمادًا على مستوى تعبير asRNA ، يمكن إنتاج أشكال مختلفة من نسخة المعنى. لذلك ، لا يقتصر التنظيم المعتمد على RNA على آلية التشغيل / الإيقاف بدلاً من ذلك ، فهو يقدم نظامًا دقيقًا للتحكم في النغمة. [1]

تعديل تنظيم ما بعد النسخ

يشير التعديل اللاحق للنسخ المباشر بواسطة asRNAs إلى استهداف mRNAs بواسطة asRNAs مباشرة وبالتالي ، تتأثر الترجمة. يتم وصف بعض خصائص هذا النوع من الحمض الريبي النووي الريبي في الحمض النووي الريبي المرتبط بـ cis-and trans-acting asRNAs. هذه الآلية سريعة نسبيًا لأن كلا من الرنا المرسال المستهدف و asRNA الخاص به يجب أن يكونا موجودين في نفس الوقت في نفس الخلية. كما هو موضح في asRNAs التي تعمل في رابطة الدول المستقلة ، يمكن أن يؤدي الاقتران mRNA-asRNA إلى انسداد دخول الريبوسوم وتدهور يعتمد على RNase H. بشكل عام ، يمكن لـ asRNAs التي تستهدف الرنا المرسال تنشيط أو تثبيط ترجمة حاسة mRNAs مع التأثير التثبيطي الأكثر وفرة. [1]

تحرير الإمكانات العلاجية

كعنصر تنظيمي ، تتمتع asRNAs بالعديد من المزايا التي يجب اعتبارها هدفًا دوائيًا. بادئ ذي بدء ، تنظم asRNAs التعبير الجيني على مستويات متعددة بما في ذلك النسخ ، والنسخ اللاحق ، والتعديل اللاجيني. ثانيًا ، إن الحمض النووي الريبي (asRNAs) الذي يعمل باتحاد الدول المستقلة هو تسلسل محدد ويظهر درجة عالية من التكامل مع جينات الاستهداف. [1] ثالثًا ، يكون مستوى التعبير عن asRNAs صغيرًا جدًا مقارنة بمستوى mRNAs المستهدف ، لذلك لا يلزم سوى كمية صغيرة من asRNAs لإحداث تأثير. من حيث الأهداف الدوائية ، يمثل هذا ميزة كبيرة لأن الجرعة المنخفضة فقط هي المطلوبة لتحقيق الفعالية. [4]

في السنوات الأخيرة ، جذبت فكرة استهداف asRNAs لزيادة التعبير الجيني بطريقة معينة موضعًا اهتمامًا كبيرًا. نظرًا لطبيعة تطوير الأدوية ، فمن الأسهل دائمًا أن تعمل الأدوية كمثبطات أو مثبطات. ومع ذلك ، هناك حاجة لتطوير الأدوية التي يمكنها تنشيط أو تنظيم التعبير الجيني مثل الجينات الكابتة للورم وعوامل النمو العصبية والجينات التي تم إسكاتها في بعض الاضطرابات المندلية. حاليًا ، يشمل نهج استعادة التعبير الجيني الناقص أو وظيفة البروتين علاجات استبدال الإنزيم وعلاجات microRNA وتقديم cDNA الوظيفي. ومع ذلك ، فإن كل منها يحمل بعض العيوب. على سبيل المثال ، غالبًا ما لا يستطيع البروتين المركب المستخدم في علاجات استبدال الإنزيم محاكاة الوظيفة الكاملة للبروتين الداخلي. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر علاجات استبدال الإنزيم التزامًا مدى الحياة وتحمل عبئًا ماليًا كبيرًا على المريض. بسبب الطبيعة المحددة للموقع لـ asRNAs والأدلة على التغيرات في تعبير asRNA في العديد من الأمراض ، كانت هناك محاولات لتصميم أليغنوكليوتيدات مفردة تقطعت بهم السبل ، يشار إليها باسم antagoNATs ، لتثبيط asRNAs وفي النهاية لزيادة التعبير الجيني المحدد. [4]

على الرغم من وعود asRNAs كأهداف للأدوية أو كأدوية مرشحة ، لا تزال هناك بعض التحديات التي يتعين معالجتها. [14] أولاً وقبل كل شيء ، يمكن أن تتحلل بسهولة أس آر إن إيه ومضادات الأنتاجون بواسطة RNase أو الإنزيمات المهينة الأخرى. لمنع تحلل الأوليوجونيوكليوتيدات العلاجية ، عادة ما يكون التعديل الكيميائي مطلوبًا. التعديل الكيميائي الأكثر شيوعًا على قليل النوكليوتيدات هو إضافة ارتباط فوسفوروثيوات إلى العمود الفقري. [5] ومع ذلك ، فإن تعديل الفسفروثيوات يمكن أن يكون مسببا للالتهابات. وقد لوحظت آثار ضارة بما في ذلك الحمى أو القشعريرة أو الغثيان بعد الحقن الموضعي لأوليغنوكليوتيدات معدلة بالفوسفروثيوات. ثانيًا ، تمثل السمية غير المستهدفة أيضًا مشكلة كبيرة. على الرغم من الطبيعة الخاصة بالموقع للأحماض الريبية النزلية الذاتية (asRNAs) الداخلية ، أظهر 10-50٪ فقط من قليل النوكليوتيدات المُصنَّعة تأثير الاستهداف المتوقع. أحد الأسباب المحتملة لهذه المشكلة هو المتطلبات العالية على بنية asRNAs ليتم التعرف عليها من خلال التسلسل المستهدف و RNase H. يمكن أن يؤدي عدم التطابق الفردي إلى تشويه في البنية الثانوية ويؤدي إلى تأثيرات بعيدة عن الهدف. [4] أخيرًا ، ثبت أن امتصاص الحمض النووي الريبي داخل الخلايا محدود. [5] على الرغم من أنه ثبت أن الخلايا العصبية والدبقية لديها القدرة على امتصاص قليل النوكليوتيدات العارية المضادة للدلالة بحرية ، إلا أن الناقلات التي يمكن تتبعها مثل الفيروسات والحويصلات الدهنية ستظل مثالية للتحكم في التركيز داخل الخلايا والتمثيل الغذائي ومراقبتهما. [4]


نقاش

على الرغم من أن مرض السل تم استغلال نظام CRISPR / Cas على نطاق واسع لتحليل تطور ووبائيات هذا العامل الممرض القديم ، ويمثل العمل المقدم هنا أول توصيف وظيفي متعمق لهذا النوع من النظام III-A. لقد أثبتنا أنه يحتوي على ميزات مميزة تميزه عن أنظمة النوع III-A الأخرى ، فإن crRNAs الناضجة لها طول موحد (∼71 nt) ، وهيكلها (فاصل سليم محاط بعلامات تسلسل متكررة 3 و 5 ، 3 ′ علامة تشكل بنية دبوس الشعر) تشبه إلى حد بعيد تلك الموجودة في نظام النوع الأول crRNAs الناضجة. يبدو أن حدث انشقاق Cas6 واحد لتكرار RNA 8 nt من نهايته 3 كافٍ لتوليد crRNA ناضج. م. مرض السل يحتوي Cas6 أيضًا على ميزات مميزة: يتم تعزيزه بقوة بواسطة أيونات المعادن ، وعلى الرغم من أن دبوس الشعر 3 الذي يتكون من تسلسل التكرار مهم لانقسام Cas6 الدقيق ، فإن نشاط انشقاق Cas6 RNA في حد ذاته مستقل عن البنية الثانوية للحمض النووي الريبي. تمثل هذه الميزات غير النمطية مزيدًا من الأمثلة على التنوع الموجود بين أنظمة CRISPR / Cas ، حتى داخل النوع 1 ، ومن المحتمل أن تشير إلى مزيد من التنوع في الآليات الوظيفية بين الأنظمة. يثير هذا الاختلاف الميكانيكي بين الأنظمة إمكانية تصميم أنظمة تحرير جيني جديدة تعتمد على النظام من النوع الثالث.

يتمثل الاختلاف الرئيسي في توليد crRNAs من النوع الثالث والنوع الأول في أنه على الرغم من اكتمال المعالجة الأولية في كلا النظامين بواسطة endoribonuclease Cas6 ، فإن النوع الثالث من crRNAs يخضع عادةً لتشذيب 3′-end واسع النطاق بعد انقسام Cas6 من السلائف crRNAs. عادةً ما تحتوي crRNAs الناضجة في أنظمة النوع الثالث التي تم فحصها حتى الآن على علامة تسلسل متكررة محفوظة 8 nt في نهايتها 5 ، وينتج عن التشذيب 3′-end بشكل عام 2 أو أكثر من crRNAs الناضجة المتميزة المشتقة من نفس تسلسل المباعد (19). في النوع III-B P. furiosus، على سبيل المثال ، يتم الحفاظ على الطرف 5 ′ الناتج عن انشقاق Cas6 في crRNA الناضج ، لكن crRNAs تخضع لمزيد من المعالجة في نهاية 3 لتوليد crRNAs بطول ∼45 أو 39 nt (41 ، 49). بصورة مماثلة، المكورات العنقودية البشروية (النوع III-A) يحتوي على crRNAs بطول 37 و 43 و 72 nt (50). ووكر وآخرون. (28) ذكرت أن 3 ′ تقليم من crRNAs في النوع III-A S. البشرة يتم تحفيز مركب (Csm) عن طريق نوكلياز غير كاس ، على الأرجح بولي ريبونوكليوتيد فسفوريلاز. ومع ذلك ، تم اكتشاف crRNAs الناضجة هنا في مرض السل كان النظام ذا حجم موحد (∼71 نانومتر الأشكال .1ب و 2) وكانت تتألف من سلسلة مباعدة سليمة محاطًا بعلامات تسلسل متكررة 8 nt 5 و 28 nt 3 (الشكل 2) ، تشكل علامة التسلسل 3 بنية دبوس الشعر. مرض السل وبالتالي فإن crRNAs تشبه إلى حد كبير crRNA الناضج من أنظمة النوع الأول ، والتي تكون ذات طول موحد وتتألف من متواليات مباعدة سليمة محاطة بعلامات تسلسل متكررة 5 ′ و 3 المعالجة الأولية للسلائف crRNA بواسطة Cas6 في مرض السل يبدو أنه كافٍ لتوليد crRNA ناضج ، مع عدم الحاجة إلى تشذيب نهاية 3. ناضجة crRNAs في بكتريا قولونية (النوع I-E) ، على سبيل المثال ، يبلغ طوله ∼61 nt ويحتوي على 8 nt 5 و 20 nt 3 علامات تسلسل متكررة (26 ، 54). لوحظ نفس بنية crRNA الناضجة في أنظمة النوع I-C ، مثل تلك الموجودة في Bacillus halodurans و Mannheimia succiniciproducs (55 ، 56) ، وفي أنظمة النوع I-F ، مثل تلك الموجودة في P. الزنجارية (22). دور Cas6 في مرض السل وبالتالي يشبه ذلك الخاص بالوحدة الفرعية CasE (Cas6e) في ملف ه. القولونية نوع نظام I-E الضروري والكافي لانقسام ما قبل crRNA. التفسير الأكثر ترجيحًا للاختلاف في بنية الرنا الناضج بينهما مرض السل وأنظمة النوع الثالث الأخرى مرض السل قد تفتقر إلى الإنزيمات المشاركة في التشذيب ثلاثي الأطراف الموجود في أنظمة النوع الثالث الأخرى. الهيكل غير النمطي لـ مرض السل قد تشير crRNAs إلى مزيد من الاختلافات في آليات إسكات الغزاة بين أنظمة النوع الثالث وتتطلب مزيدًا من التحقيق.

تم تصنيف Cas6 كعضو في عائلة Cas6-I-III الفائقة من endoribonucleases التي تحتوي على RRM مزدوج / طية ferroxin. نشاط نوكلياز داخلي مرض السل كان Cas6 الذي لوحظ هنا يعتمد على أيونات المعادن ثنائية التكافؤ Ca 2+ و Mn 2+ يعززان نشاط Cas6 بقوة (الشكل 3).ب). كما أظهرت فحوصات قياس المسعرات الحرارية المتساوية ذلك مرض السل يربط Cas6 Ca 2+ مباشرة (الشكل 3ج). لم يتم ملاحظة انقسام الحمض النووي الريبي المعتمد على أيونات Cas6 في البكتيريا الأخرى. على سبيل المثال ، Cas6 في النوع III-B P. fiiriosus، ومثيلاتها Cas6 Csy4 في النوع I-F الزائفة الزنجارية، و Cas6e في النوع I-E بكتريا قولونية تم الإبلاغ عن أنها تشق نصوص CRISPR بطريقة مستقلة عن أيونات معدنية ، مع إضافة أيونات معدنية أو EDTA ليس لها أي تأثير على نشاط انشقاق Cas6 في المختبر (22 ، 25 ، 35). ومع ذلك ، فقد لوحظ انقسام الحمض النووي المعتمد على أيون المعدن في Cas5d ، و ب. هالودوران متماثل Cas6 (57). من المعروف أن أيونات المعادن تلعب مجموعة متنوعة من الأدوار في آليات التفاعل ، بما في ذلك التغييرات الهيكلية حول الموقع النشط في بعض الإنزيمات أو تعمل كمنشطات محبة للكهرباء لروابط P-O و C-O (58 ، 59). مطلوب مزيد من العمل لتحديد ما إذا كانت أيونات المعادن مرتبطة مرض السل Cas6 في موقعه النشط وكيف تؤثر على نشاط Cas6.

يتم حفظ المخلفات المتضمنة في انشقاق Cas6 بدرجة عالية بين متماثلات Cas6. مرض السل Cas6 ، مثل T. ثيرموفيلوس Cse3 و P. fiiriosus يتكون Cas6 من طيات فيرودوكسين مكررة مفصولة بشق مركزي يحتوي على حلقة محفوظة غنية بالجليسين (25 ، 60) (الشكل 3E). أشارت التقارير السابقة إلى أن بقايا الهيستيدين المحفوظة للغاية والموجودة بجوار الحلقة الغنية بالجليسين هي بقايا موقع نشط مهمة لتحفيز انقسام RNA المتكرر CRISPR (22 ، 35 ، 61). هنا ، أدى تحور بقايا His99 و Gly295 / Gly297 المقابلة (الموجودة في طيات RRM / ferroxin مختلفة) إلى الألانين إلى إلغاء انقسام Cas6 الدقيق (الشكل 3).F). على الرغم من أن البروتين المتحور G295A / G297A لا يمكنه ربط الحمض النووي الريبي المتكرر ، إلا أن البروتين المتحور H99A كان لا يزال قادرًا على ربط الحمض النووي الريبي المتكرر (الشكل 3).جي) ، مما يؤكد أهمية هذه المخلفات الثلاثة في التعرف على Cas6 وانشقاق الركيزة RNA في مرض السل.

يمكن تقسيم إنزيمات Cas6 ، وهي فئة من نوكليازات endoribonucleases عالية التسلسل والهيكل ، والتي تشارك في نضج crRNAs في أنظمة CRISPR من النوع الأول والثالث (34 ، 62) ، على نطاق واسع إلى فئتين بناءً على خصوصية الركيزة: 1) شق ركائز الحمض النووي الريبي التي لها بنية دبوس الشعر و 2) شق ركائز الحمض النووي الريبي التي تفتقر إلى هياكل دبوس الشعر. في حالة تعطل بنية دبوس الشعر أو في حالة حدوث طفرة في تسلسل قاعدتها النهائية ، يتم إلغاء نشاط الانقسام لأنزيمات Cas6 التي تشق ركائز الحمض النووي الريبي مع الهياكل الحلقية الجذعية. على سبيل المثال ، يؤدي تعطيل حلقة دبوس الشعر أو تغيير قواعد جذع دبوس الشعر إلى إلغاء نشاط انقسام S. البشرة (النوع III-A) Cas6 (62). في أنواع مثل Pyrococcus Horikoshii أن تشق crRNAs التي لا تحتوي على بنية دبوس الشعر ، ويعتمد الانقسام الدقيق على تسلسل crRNA نفسه ، وسوف تلغي الطفرات الأساسية المحددة الانقسام (24 ، 63). ال مرض السل من المتوقع أن يحتوي تسلسل التكرار على دبابيس شعر تقع عند طرفيها 5 و 3. أشارت البصمة RNA إلى أن أهم موقع لانقسام Cas6 يقع في دبوس الشعر B ، وهو أكبر دبابيس الشعر. ينشق Cas6 في القاعدة الطرفية لدبوس الشعر B ، ويولد شريط انشقاق 28 nt RNA. على عكس الوضع العام الموصوف سابقًا ، على الرغم من أن تعطيل بنية دبوس الشعر B أو تحور قواعده الطرفية أدى إلى اختفاء منتج الانقسام الرئيسي 28 nt RNA ، إلا أن نشاط الانقسام الكلي لـ Cas6 لم يتأثر (الشكل 4).ب). ومع ذلك ، فإن تغيير تسلسل حلقة دبوس الشعر لم يؤثر على توليد شريط الانقسام الرئيسي 28 nt. تشير هذه النتائج إلى أنه على الرغم من أن وجود بنية دبوس الشعر وتسلسل قاعدتها النهائية مهمان جدًا للانقسام الدقيق بواسطة مرض السل Cas6 ، فهي ليست مطلوبة لنشاط الانقسام Cas6 في حد ذاته.

كشفت التحقيقات المكثفة لأجهزة المناعة بدائية النواة CRISPR / Cas في السنوات الأخيرة عن مستويات كبيرة من التنوع بين الأنواع في مكونات البروتين الخاصة بها وعمليات النسخ وأدت إلى العديد من عمليات إعادة تصنيف أنظمة CRISPR (6). الأدلة المقدمة هنا تشير إلى أنه على الرغم من أن مرض السل تم تصنيف نظام CRISPR / Cas بشكل صحيح على أنه النوع III-A استنادًا إلى مكوناته البروتينية الرئيسية ، وتشبه بنية crRNA الناضج إلى حد كبير تلك الموجودة في أنظمة النوع الأول من حيث أن المعالجة الشاملة ثلاثية الأطراف النموذجية لأنظمة النوع الثالث غير مطلوبة على ما يبدو . نحن نفترض ذلك مرض السل قد تفتقر إلى الإنزيمات المسؤولة عن المعالجة ثلاثية الأطراف في أنظمة أخرى من النوع الثالث. نظرًا لتحديد الإنزيمات المشاركة في آليات المعالجة ثلاثية الأطراف في أنظمة أخرى من النوع الثالث ، فقد يصبح من المناسب إنشاء فئة فرعية خاصة داخل أنظمة النوع III-A لـ م. مرض السل.

باختصار ، لقد تميزنا بشكل منهجي ببنية crRNA الناضجة وتوليد crRNA في مرض السل، أحد مسببات الأمراض القديمة التي لا تزال كارثة على مشهد الصحة العامة العالمية. لأن مرض السل هو مُمْرِض بطيء النمو ومستعصٍ تجريبياً ، ولا يزال يتعين توضيح العديد من جوانب بيولوجيته الأساسية وتأثيرها على التسبب في المرض. الفهم الجديد لـ مرض السل سيكون نظام CRISPR / Cas الذي تم إنشاؤه هنا ذا قيمة في الدراسات حول تطور ووبائيات مرض السل ويضع أساسًا قويًا لمزيد من التحقيق في آليات هذا النوع غير النموذجي من نظام CRISRP / Cas من النوع الثالث وتقييم إمكانية استخدام عناصر من هذا النوع من نظام CRISPR / Cas الثالث في تحرير الجينوم.


مراجع

A. J. Bogdanove، وآخرون., الدقة الأحماض النووية. 46، 4845-4871 (2018) ، دوى: 10.1093 / nar / gky289.

إيه سي كومور ، إيه إتش بدران ، دي آر ليو ، زنزانة 168، 20–36 (2017) ، دوى: 10.1016 / j.cell.2016.10.044.

D. E. Paschon وآخرون., نات. بالاتصالات 10، 1133 (2019) ، دوى: 10.1038 / s41467-019-08867-x.

X. S. Liu وآخرون., زنزانة 172، 979-992 (2018) ، دوى: 10.1016 / j.cell.2018.01.012.

L. Villiger وآخرون., نات. ميد. 24، 1519-1525 (2018) ، دوى: 10.1038 / s41591-018-0209-1.

A.Pickar-Oliver ، C.A.Gersbach ، نات. القس مول. خلية بيول. 20, 490–507 (2019), doi: 10.1038/s41580-019-0131-5.

C. T. Charlesworth وآخرون., نات. Med. 25, 249–254 (2019), doi: 10.1038/s41591-018-0326-x.

Featured Participants

Featured Product

Genomic Sample Preparation

Xdrop from Samplix enables single-molecule resolution and bias-free enrichment of genomic regions longer than 100 kilobases from as little as 1 ng genomic DNA. It fits seamlessly with any sequencing platform and works equally well with both short-read and long-read sequencing systems. The Xdrop system builds on Samplix’ proprietary technologies to partition single molecules in easy-to-use microfluidics cartridges. The product comprises an Xdrop instrument for cartridge control, different microfluidics cartridges, and several molecular biology consumables optimized to work with the cartridges. Sample preparation is unique, as it provides for PCR-free enrichment of large single molecules spanning entire genomic regions. The long-range information may comprise phasing, structural variants, repetitive sequences, and more. Furthermore, as it requires very little knowledge of the target sequence, the Xdrop enrichment may also be applied to investigate uncharted genomic regions.

Cas9 mRNA

For preclinical and other applications where you need to minimize off-target Cas9 activity, use System Biosciences’ injection- and transfection-ready PrecisionX Cas9 SmartNickase mRNA. Unlike the wildtype Cas9 protein, which introduces double-strand breaks, Cas9 SmartNickase introduces paired nicks at the guide RNA–directed site. Creating nicks favors the higher-fidelity homologous recombination process over nonhomologous end joining, with paired nicking shown to reduce off-target activity by 50- to 1,500-fold in cell lines and to facilitate gene knockout in mice without losing on-target cleavage efficiency. As with all our Cas9 delivery options, Cas9 SmartNickase mRNA is functionally validated and comes backed by our expert technical support team—if you’ve got a genome engineering question, just email [email protected]

Custom Oligo Pools

Integrated DNA Technologies has launched oPools Oligo Pools—ready-to-use pools of high-quality DNA oligonucleotides (oligos) between 40–350 nucleotides in length. Pooled oligos are widely used in high-throughput workflows in synthetic biology, diagnostic development, and drug discovery. oPools’ industry-leading low error rate of less than 1 in 2,000 nucleotides, coupled with high per oligo yields, facilitate fast, reliable downstream workflows for projects including CRISPR library construction, protein screening, and gene assembly. For synthetic biologists, quick access to affordable, high-quality oligo pools that can go directly into their pipeline without the hands-on time required for PCR amplification allows for faster, more impactful design–build–test cycles—which are so critical to discovery. There is no minimum order—pools are compatible with downstream cloning methods and have a turnaround time of just four to seven business days from ordering to delivery. oPools unparalleled concentration, uniformity, and accuracy assure high target specificity and provide researchers with the utmost confidence in results.

CRISPR RNP Transfection

Many researchers need to transfect plasmid DNA, short interfering RNA, messenger RNA, and CRISPR ribonucleoprotein (RNP) into cells. For this purpose, OriGene offers Viromers, a complete transfection reagent portfolio and a technology breakthrough that takes advantage of a viral fusion mechanism (hence their name) to help you efficiently deliver genes into cells. Viromer CRISPR was developed to transfect CRISPR RNP into cells with high efficiency. For CRISPR genome editing, Cas9 protein and guide RNA complexes (RNP) are sometimes preferred, since they are fast, have fewer off-target effects, and leave no footprint. This reagent has a low impact on cell viability and physiology, is easily scalable, facilitates guide RNA screening, and is suitable for high-throughput screening.

Homogenizer Spin Column

Porvair Sciences announce the Chromatrap Homogenizer Spin Column, which provides a cost-effective way to homogenize cells and tissues lysates in a single step. Developed as a quick, clean, and efficient alternative to syringe- and needle-homogenization techniques, the Homogenizer offers labs an easy-to-use, downstream sample-processing tool for a wide range of applications, including plasmid miniprep and midiprep and RNA extraction protocols. Good homogenization of cells and tissue lysates enables improvement in yield and quality of obtained plasmids and RNA for downstream applications. The unique proprietary bioshredding Vyon polymer contained within the column reduces lysate viscosity and captures insoluble debris by centrifugation, thereby eliminating the possibility of contamination.

Submit your new product press release/description or product literature information to [email protected] Visit Science New Products for more information.

Newly offered instrumentation, apparatus, and laboratory materials of interest to researchers in all disciplines in academic, industrial, and governmental organizations are featured in this space. Emphasis is given to purpose, chief characteristics, and availability of products and materials. Endorsement by Science or AAAS of any products or materials mentioned is not implied. Additional information may be obtained from the manufacturer or supplier.

Chris Tachibana

Chris Tachibana is a science writer based in Seattle, USA, and Copenhagen, Denmark.


If a DNA of an organism is genetically modified, the resulting organism is called a "knockdown organism." If the change in gene expression is caused by an oligonucleotide binding to an mRNA or temporarily binding to a gene, this leads to a temporary change in gene expression that does not modify the chromosomal DNA, and the result is referred to as a "transient knockdown". [1]

In a transient knockdown, the binding of this oligonucleotide to the active gene or its transcripts causes decreased expression through a variety of processes. Binding can occur either through the blocking of transcription (in the case of gene-binding), the degradation of the mRNA transcript (e.g. by small interfering RNA (siRNA)) or RNase-H dependent antisense, or through the blocking of either mRNA translation, pre-mRNA splicing sites, or nuclease cleavage sites used for maturation of other functional RNAs, including miRNA (e.g. by morpholino oligos or other RNase-H independent antisense). [1] [2]

The most direct use of transient knockdowns is for learning about a gene that has been sequenced, but has an unknown or incompletely known function. This experimental approach is known as reverse genetics. Researchers draw inferences from how the knockdown differs from individuals in which the gene of interest is operational. Transient knockdowns are often used in developmental biology because oligos can be injected into single-celled zygotes and will be present in the daughter cells of the injected cell through embryonic development. [3] The term gene knockdown first appeared in the literature in 1994 [4]

RNA interference (RNAi) is a means of silencing genes by way of mRNA degradation. [5] Gene knockdown by this method is achieved by introducing small double-stranded interfering RNAs (siRNA) into the cytoplasm. Small interfering RNAs can originate from inside the cell or can be exogenously introduced into the cell. Once introduced into the cell, exogenous siRNAs are processed by the RNA-induced silencing complex (RISC). [6] The siRNA is complementary to the target mRNA to be silenced, and the RISC uses the siRNA as a template for locating the target mRNA. After the RISC localizes to the target mRNA, the RNA is cleaved by a ribonuclease.

RNAi is widely used as a laboratory technique for genetic functional analysis. [7] RNAi in organisms such as C. ايليجانس و Drosophila melanogaster provides a quick and inexpensive means of investigating gene function. في C. ايليجانس research, the availability of tools such as the Ahringer RNAi Library give laboratories a way of testing many genes in a variety of experimental backgrounds. Insights gained from experimental RNAi use may be useful in identifying potential therapeutic targets, drug development, or other applications. [8] RNA interference is a very useful research tool, allowing investigators to carry out large genetic screens in an effort to identify targets for further research related to a particular pathway, drug, or phenotype. [9] [10]

A different means of silencing exogenous DNA that has been discovered in prokaryotes is a mechanism involving loci called 'Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats', or CRISPRs. [11] CRISPR-associated (cas) genes encode cellular machinery that cuts exogenous DNA into small fragments and inserts them into a CRISPR repeat locus. When this CRISPR region of DNA is expressed by the cell, the small RNAs produced from the exogenous DNA inserts serve as a template sequence that other Cas proteins use to silence this same exogenous sequence. The transcripts of the short exogenous sequences are used as a guide to silence these foreign DNA when they are present in the cell. This serves as a kind of acquired immunity, and this process is like a prokaryotic RNA interference mechanism. The CRISPR repeats are conserved amongst many species and have been demonstrated to be usable in human cells, [12] bacteria, [13] C. ايليجانس, [14] zebrafish, [15] and other organisms for effective genome manipulation. The use of CRISPRs as a versatile research tool can be illustrated [16] by many studies making use of it to generate organisms with genome alterations.

Another technology made possible by prokaryotic genome manipulation is the use of transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to target specific genes. [17] TALENs are nucleases that have two important functional components: a DNA binding domain and a DNA cleaving domain. The DNA binding domain is a sequence-specific transcription activator-like effector sequence while the DNA cleaving domain originates from a bacterial endonuclease and is non-specific. TALENs can be designed to cleave a sequence specified by the sequence of the transcription activator-like effector portion of the construct. Once designed, a TALEN is introduced into a cell as a plasmid or mRNA. The TALEN is expressed, localizes to its target sequence, and cleaves a specific site. After cleavage of the target DNA sequence by the TALEN, the cell uses non-homologous end joining as a DNA repair mechanism to correct the cleavage. The cell's attempt at repairing the cleaved sequence can render the encoded protein non-functional, as this repair mechanism introduces insertion or deletion errors at the repaired site.

So far, knockdown organisms with permanent alterations in their DNA have been engineered chiefly for research purposes. Also known simply as knockdowns, these organisms are most commonly used for reverse genetics, especially in species such as mice or rats for which transient knockdown technologies cannot easily be applied. [3] [18]

There are several companies that offer commercial services related to gene knockdown treatments.


Difference between micro RNA and short-interfering RNA and CRISPR Cas 9 system? - مادة الاحياء

RNA-guided nucleases (RGNs) provide sequence-specific gene regulation through base-pairing interactions between a small RNA guide and target RNA or DNA. RGN systems, which include CRISPR-Cas9 and RNA interference (RNAi), hold tremendous promise as programmable tools for engineering and therapeutic purposes. However, pervasive targeting of sequences that closely resemble the intended target has remained a major challenge, limiting the reliability and interpretation of RGN activity and the range of possible applications. Efforts to reduce off-target activity and enhance RGN specificity have led to a collection of empirically derived rules, which often paradoxically include انخفضت binding affinity of the RNA-guided nuclease to its target. We consider the kinetics of these reactions and show that basic kinetic properties can explain the specificities observed in the literature and the changes in these specificities in engineered systems. The kinetic models described provide a foundation for understanding RGN targeting and a necessary conceptual framework for their rational engineering.

Present address: Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA 02142, USA


CONCLUSION

The startling discovery that nucleotide sequence information can cross cell boundaries in the form of regulatory RNA necessitates a revision of our understanding of animals. The movement of mobile RNA between cells is minimally a new form of cell-to-cell communication within animals. The ability of foreign mobile RNA to enter and affect gene regulation in some animals hints at intimate communication between an animal and its environment. Extending this concept to an extreme, we can imagine a scenario where an animal cell responds to imported RNA that was exported from a cell in another organism. Much work remains to be done to discover how natural selection has favored organisms that can transport RNA across membranes to evolve gene regulatory interactions across the animal kingdom.


شاهد الفيديو: MicroRNA Studies - Anna M. Krichevsky (أغسطس 2022).