معلومة

هل يمكنني استخدام صبغة تحميل الحمض النووي التجارية لعينات الحمض النووي الريبي الخاصة بي دون تحطيمها؟

هل يمكنني استخدام صبغة تحميل الحمض النووي التجارية لعينات الحمض النووي الريبي الخاصة بي دون تحطيمها؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كنت أتساءل عما إذا كان يتعين علي استخدام صبغة تحميل خاصة من الحمض النووي الريبي أو هل يمكنني تشغيل عينات من الحمض النووي الريبي بصبغة تحميل منتظمة تستخدم للحمض النووي؟


يتطلب التعامل مع الحمض النووي الريبي مزيدًا من العناية ، خاصةً باستخدام رؤوس وأنابيب وكواشف ماصة خالية من RNase ، لمنع تلوث RNase. عادةً ما تشير أدوات المختبر والكواشف الشائعة إلى ما إذا كانت خالية من RNase. إذا لم يكن هناك ذكر من هذا القبيل مكتوب على الصندوق أو الملصق ، فيجب أن تفترض أنه ليس خاليًا من RNase ويجب ألا تستخدمه للتعامل مع RNA الخاص بك.

تحقق مما إذا كانت صبغة التحميل معتمدة من أنها خالية من RNase (يجب كتابتها على الأنبوب ، أو من السهل اكتشافها على موقع الشركة المصنعة باستخدام الرقم المرجعي للمنتج). إذا كان الأمر كذلك ، وكنت تستخدم حصريًا أدوات وكواشف معتمدة خالية من RNase ، فربما يكون أنبوب صبغة التحميل أو أي شيء آخر قد تلوث من قبل أحد زملائك في العمل.


العزل المتزامن للحمض النووي عالي الجودة ، والحمض النووي الريبي ، والميرنا والبروتينات من الأنسجة للتطبيقات الجينية

أحدثت تقنيات الجينوم ثورة في فهمنا لأمراض مندلية المعقدة والسرطان. تمثل الأورام الصلبة العديد من التحديات للتحليلات الجينومية ، مثل عدم تجانس الورم وتلوث الورم بالسدى المحيط والخلايا الليمفاوية المتسللة. لقد طورنا بروتوكولًا لـ (1) تحديد الأنسجة ذات النقاوة الخلوية العالية على أساس التحليلات النسيجية للأقسام المجاورة مباشرة و (2) استخراج الحمض النووي الجيني (gDNA) ، و mRNA ، والحمض النووي الريبي غير المشفر (ncRNA المخصب في ميرنا) والبروتين من نفس الأنسجة. بعد اختيار الأنسجة ، يمكن الحصول على حوالي 12-16 عملية استخلاص للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين يوميًا. بالمقارنة مع الأساليب المماثلة الأخرى ، سمحت لنا هذه المنهجية السريعة والموثوقة بتحديد الطفرات في الأورام بحساسية ملحوظة وإجراء تحليلات تكاملية لمجموعات بيانات الجينوم الكامل والإكسوم ، وأرقام نسخ الحمض النووي (بواسطة مصفوفات تعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات (SNP)) ، بيانات التعبير الجيني (عن طريق التنميط النسخي و PCR الكمي (qPCR)) ومستويات البروتين (عن طريق النشاف الغربي والتحليل الكيميائي المناعي) من نفس العينات. على الرغم من أننا ركزنا على سرطان الخلايا الكلوية ، إلا أنه يمكن تكييف هذا البروتوكول مع تغييرات طفيفة على أي نسيج بشري أو حيواني للحصول على أحماض وبروتينات عالية الجودة وعالية الغلة.


التحقق من صحة تصميم التمهيدي

يعد التحقق من صحة تصميم التمهيدي أمرًا مهمًا بشكل خاص عند اعتماد الاشعال من منشور سابق أو استخدام مقايسة يتم توفيرها تجاريًا. يمكن مراجعة التصميم التمهيدي فيما يتعلق بإرشادات تصميم المقايسة المقدمة في تصميم فحص PCR / qPCR / dPCR. من الأهمية بمكان ضمان ما يلي:

  • الاشعال متماثل مع التسلسل المستهدف المطلوب.
  • التمهيدي التكميلي العكسي صحيح. تحقق بعناية من الأوامر الأساسية التكميلية العكسية (باستخدام http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html).
  • تم الكشف عن متغيرات لصق مناسبة.
  • تم تجنب SNPs ما لم يكن مطلوبًا للمقايسة.
  • لا تعتمد oligos و amplicon بنية ثانوية.
  • هناك احتمالية منخفضة لتهجين القليل من التفاعل مع بعضها البعض.

التمهيدي ديمر

قد تؤدي قدرة البرايمر على التهجين مع بعضها البعض ، خاصة في الطرف الثالث ، إلى تمديد التمهيدي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل وتشكيل منتجات مستقلة عن الهدف ، تُعرف باسم ثنائيات التمهيدي. عندما يتم إنتاج منتجات ديمر التمهيدي وتضخيمها ، فإنها تحول مكونات التفاعل بعيدًا عن تخليق المنتج المطلوب ، وبالتالي تقليل كفاءة الفحص والحساسية. لذلك ، تعتبر ثنائيات التمهيدي مشكلة في التفاعلات التي تستخدم كل من الكشف المستند إلى المسبار و SYBR Green I القائم على الصبغة. مع الاكتشاف القائم على الصبغة مثل SYBR Green I ، تؤثر ثنائيات التمهيدي أيضًا على خصوصية الفحص لأن الصبغة غير المحددة المرتبطة بالحمض النووي ستلتصق بالبادئات ويتم اكتشافها جنبًا إلى جنب مع المنتج المطلوب. لذلك ، يجب تجنب البادئات التي من المحتمل أن تشكل ثنائيات التمهيدي.

التنبؤ التمهيدي ديمر

لتحديد إمكانية تكوين ثنائي التمهيدي ، استخدم برنامج تصميم التمهيدي لتحليل تشكيل مزدوج. يوفر OligoArchitect تفاصيل قوة التهجين ثنائي الأبعاد والتهجين المتقاطع (الشكل 9.1). يجب أن تكون أي ثنائيات ثلاثية الأطراف مكونة إما عن طريق التهجين التمهيدي مع نفسها أو مع شريكها ضعيفًا جدًا (ΔG ≥ –2.0 kcal ، الشكل 9.1).

كيف يمكنك تقليل ديمر التمهيدي؟

يجب تجنب أي جهاز تمهيدي يحتوي على كل من الطرفية ΔG & lt –2.0 kcal و 3’-end (5’-المتداخلة). يجب أن يكون الثنائى الأقوى بشكل عام غير مستقر (ΔG ≥ –6.0 kcal). لتجنب ثنائيات 3’-terminal القوية مع الحفاظ على الخصوصية ، اختر البادئات التي تحتوي على 2 G أو C في آخر 5 قواعد ، 1 G أو C في القواعد الثلاثة الأخيرة و A أو T في 3’-end (الشكل 9.1).

الشكل 9.1. تحليل البرايمر لإمكانية التمهيدي. تم تحليل تسلسلات التمهيدي باستخدام برنامج تصميم OligoArchitect لتحديد قدرتها على تشكيل الدوبلكس. يتم عرض ديمير ذاتي وإمكانات ثنائيات متقاطعة لأفضل خيار تمهيدي. سيعطي Multiplex qPCR أفضل النتائج إذا كانت جميع البادئات في التفاعل لها درجات حرارة انصهار مماثلة (فرق Tm 2 درجة مئوية) ولا تشكل ثلاث نسخ مزدوجة قوية (ΔG ≥ –2.0 kcal).

تحسين تراكيز البرايمر ودرجة حرارة التلدين (T.أ)

عند تحسين ظروف الفحص باستخدام تركيز التمهيدي ، يكون T ثابتأ (عادة 60 درجة مئوية) يتم اختياره ويتم التعامل مع الظروف المثلى لكل تمهيدي بشكل مستقل. يعد هذا أمرًا بالغ الأهمية عند تصميم اختبار ليتم تشغيله في تعدد الإرسال ، حيث يجب أن تعمل جميع التفاعلات في نفس درجة حرارة التلدين ، وهو أسلوب يمكن استخدامه أيضًا لإنقاذ المقايسات سيئة الأداء التي لا يتوفر لها تصميم بديل. تتمثل الطريقة الأبسط تقنيًا في تحديد تركيز تمهيدي ثابت ثم تحسين T.أ اختيار أفضل نتيجة لتلك البرايمر مجتمعة. هذا هو النهج المفضل عند استخدام عدة فحوصات واكتشاف صبغة ربط dsDNA ، مثل SYBR ® Green I. ومع ذلك ، فإن هذا الأسلوب يتطلب أداة يمكنها تشغيل برامج التفاعل في نفس الوقت باستخدام T مختلف.أ والخيارات.

تحسين تركيزات التمهيدي

عند استخدام qPCR المستندة إلى المسبار ، غالبًا ما يتم الحصول على نتائج مرضية باستخدام التركيزات النهائية لكل من البادئات عند 500 نانومتر والمسبار عند 250 نانومتر ، خاصة إذا كان هدف PCR وفير والحساسية القصوى غير مطلوبة. تكون التركيزات الأقل إلى حد ما من التمهيدي ، بين 200 نانومتر و 400 نانومتر ، أفضل عادةً عند استخدام الكشف المستند إلى صبغة SYBR Green I لتقليل التضخيم غير المحدد وعند تحسين تفاعلات الإرسال المتعدد. للتحقق من أن الشروط القياسية مناسبة للاستخدام ، قم بإجراء تحليل منحنى قياسي (انظر تقييم الفحص). إذا كان الاكتشاف خطيًا وقابلًا للتكرار وكان التدرج بين -3.2 و -3.5 على مدى التركيزات المستهدفة المتوقعة في العينات ، فقد لا يكون من الضروري تحسين تركيزات التمهيدي والمسبار بشكل أكبر.

بعض المؤشرات التي تدل على أن المقايسة ليست محسَّنة بشكل جيد هي أنها تفتقر إلى القابلية للتكاثر بين التكرارات وهي عمومًا غير فعالة وغير حساسة. عادة ما يتم اختبار أداء الفحص في مجموعة من تركيزات التمهيدي ، على سبيل المثال ، من 50-800 نانومتر ، باستخدام كل تمهيدي في كل تركيز (الشكل 9.2 للحصول على بروتوكول كامل ، انظر الملحق أ ، تحسين البروتوكولات التمهيدي).

الشكل 9.2. مثال على التحسين التمهيدي. تصميم شرائط 8 أنابيب (الجانب العلوي والجانب الأيسر) ولوحة PCR لتخفيف وتوزيع البادئات.

توليفة من التركيزات تنتج أدنى درجة مئويةف ، أدنى اختلاف في التكرارات ويتم اختيار NTC سلبي (الشكل 9.3) 2.

الشكل 9.3. النتائج من تحسين تركيز البادئات PCR من فحص صبغة SYBR Green I. أ) المبادئ التوجيهية المعمول بها توصي باختبار مجموعة متنوعة من تركيزات التمهيدي (F) والعكس (R). في هذا المثال ، تم اختبار 50 نانومتر إلى 600 نانومتر معًا لتحديد التركيز الأمثل للمقايسة. في هذه التجربة ، يوجد اختلاف كبير في Cq بسبب تركيزات مختلفة من التمهيدي ، مما يوضح كيف يمكن أن يؤثر ذلك على البيانات النهائية (بيانات من Jens Stolte ، EMBL). ب) تظهر هذه التجربة الأمثل للمقايسة جيدة التصميم والتنوع بسبب تركيز التمهيدي. تم اختيار تركيبة التمهيدي الأمامية والخلفية 400 نانومتر على أنها مثالية لأن هذا المزيج يمثل أدنى تركيزات التمهيدي التي أسفرت بشكل متكرر عن قيم Cq الأولى مع الاحتفاظ بمنحنى السيني.

إذا كان أحد الأهداف في تفاعل تعدد الإرسال أكثر وفرة بشكل ملحوظ من الآخر (الأهداف) الأخرى أو إذا كان زوج واحد من التمهيدي ينتج C أقل بكثيرف بخلاف الآخرين ، قد يهيمن تضخيم هذا الهدف على التفاعل ، باستخدام مكونات التفاعل قبل اكتشاف الأهداف الأخرى. قد يسمح ضبط تراكيز البادئات بتضخيم أكثر توازناً لجميع الأهداف. لتحديد ما إذا كانت هذه التعديلات مفيدة ، قم بإعداد منحنيات قياسية (انظر تقييم الفحص) التي تغطي نطاق الأهداف المتوقعة لكل زوج تمهيدي بمفرده (طبع مفرد) ومع كل البادئات مجتمعة (تعدد الإرسال). إذا أعطت تفاعلات تعدد الإرسال وحيدة الإرسال نتائج مماثلة ، فإن التركيزات الأولية تكون مناسبة. من ناحية أخرى ، من المرجح أن يؤدي تحسين تركيزات التمهيدي إلى تحسين النتائج إذا كانت الحساسية غير مقبولة في تفاعلات تعدد الإرسال. تقليل تركيزات البرايمر لأزواج البرايمر التي ينتج عنها انخفاض Cف القيم و / أو زيادة التركيزات لتلك التي تنتج نسبة عالية من Cف القيم ، في حدود 50-500 نانومتر.

تحسين درجة حرارة التلدين التمهيدي

يتم إجراء فحوصات PCR الكمية عمومًا باستخدام برامج دورة درجة الحرارة من خطوتين أو ثلاث خطوات ، عادةً مع 35-40 دورة. دورة تفاعلات من خطوتين بين درجتين حرارة ، عادة 95 درجة مئوية (عادة لمدة 10-15 ثانية) و 60 درجة مئوية (عادة لمدة 30-60 ثانية أو 5-10 ثوان في ظروف سريعة). يتم اختيار تفاعلات درجة الحرارة من خطوتين عند تشغيل مقايسات مسبار مزدوج العلامات (TaqMan أو التحلل المائي) لأن استطالة درجة الحرارة المنخفضة تعزز نشاط نوكلياز خارجي لبوليميراز الحمض النووي وتثبط إزاحة المسبار. سيكون هذا هو بروتوكول حالة التدوير المفضل لإجراء العديد من الاختبارات المختلفة تحت نفس المعلمات. ومع ذلك ، فإن عيب استخدام الطريقة المكونة من خطوتين هو أنه يقلل من الخيارات المحتملة لتصميم التمهيدي ويحد من تحسين الفحص لتركيز التمهيدي وحده بسبب عدم وجود درجة حرارة التلدين (Tأ) التحسين ممكن.

يُفضل استخدام بروتوكول التدوير المكون من ثلاث خطوات عندما تكون التسلسلات المستهدفة معقدة ويكون من الصعب تحسين البادئات المختارة أو أن نظام الكشف المستخدم لا يعتمد على استخدام مسبار التحلل المائي. دورة إستراتيجيات من ثلاث خطوات بين: 95 درجة مئوية (عادةً لمدة 10 ثوانٍ) ، ودرجة حرارة التلدين (بين 55 درجة مئوية و 65 درجة مئوية ، عادةً لمدة 10-20 ثانية أو 5 ثوانٍ في ظل ظروف سريعة) و 72 درجة مئوية (عادةً لـ 20-30 ثانية أو 15-20 ثانية في ظل ظروف سريعة). في هذه الحالة ، فإن حرف T.أ يمكن تحسينها لزيادة تحسين أداء الفحص باستخدام البروتوكول التالي:

  • ابدأ عند الطرف السفلي من حرف T.أ النطاق المراد اختباره ، والذي يتم تحديده بواسطة T.أ من البادئات ، وزيادة درجة الحرارة تدريجيًا بزيادات تدريجية (عادةً ما يتم الاختبار بين 55 درجة مئوية و 65 درجة مئوية). تحتوي بعض الأدوات على كتل متدرجة تسهل تحسين درجة الحرارة في دورة واحدة.
  • اختبر كل منتج من منتجات التفاعل من أجل النوعية ، إما عن طريق تحليل منحنى الذوبان بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل أو الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز ، كما هو موضح أدناه.
  • درجة حرارة التلدين المثلى هي التي ينتج عنها أدنى درجة مئويةف، NTC سلبي ، تحليل منحنى الذوبان يكشف عن اكتشاف منتج معين وإمكانية استنساخ عالية بين التفاعلات المكررة.

إذا كانت درجة حرارة التلدين منخفضة جدًا ، فسيكون التفاعل غير محدد. ومع ذلك ، إذا كانت درجة الحرارة مرتفعة للغاية ، فقد يؤثر الصرامة على كفاءة التفاعل ، مما يؤدي إلى نقص التضخيم أو ارتفاع شديد في درجة الحرارةف القيم والعوائد السيئة للغاية وقابلية التكاثر المنخفضة.

يظهر مثال على تحسين درجة الحرارة في الشكل 9.4. في هذه الحالة (الشكل 9.4A) ، تم إجراء تفاعلات متطابقة على كتلة متدرجة PCR بحيث كانت درجة حرارة التلدين بين 47.8 درجة مئوية و 71.7 درجة مئوية. التلدين عند 64.8 درجة مئوية و 61.7 درجة مئوية ينتج عنه درجة مئوية متطابقةف القيم ولكن درجة الحرارة المنخفضة قليلاً تنتج عائدًا أعلى من المنتج ، كما يتضح من تألق نقطة نهاية أعلى وتفاعل بكفاءة أعلى على ما يبدو (يُشار إليه بتدرج مخطط التضخيم). يتطلب التحديد المطلق للكفاءة تقييمًا قياسيًا للمنحنى (انظر تقييم الفحص) أو استخدام خوارزميات تحديد كفاءة الأنبوب الواحد 3،4. الجزء الثاني من الشكل (الشكل 9.4B) مقارنة بين سلوك البادئات تحت ظروف تفاعل متطابقة ولكن في خلطات كاشف مختلفة. هنا ، من الواضح أن تكوين المخزن المؤقت يؤثر على استنساخ المقايسة ونطاق درجات الحرارة التي يتم تحقيق البيانات المستقرة عليها. أخيرًا ، تم تصميم فحصين مستقلين لنفس الجين المستهدف وتم تحسينهما في كل مخزن مؤقت. كما هو مبين الشكل 9.4C، كل عازلة تتطلب درجة حرارة مثالية مختلفة لإنتاج C قابلة للمقارنةف بيانات من زوجين التمهيدي (61.7 درجة مئوية في LuminoCt و 58.4 درجة مئوية في KiCqStart).

الشكل 9.4. التحسين التمهيدي باستخدام Ta. أ) تم اختبار مجموعة من درجات حرارة التلدين للتفاعلات المتطابقة. يؤدي التلدين عند 64.8 درجة مئوية و 61.7 درجة مئوية إلى قيم Cq متطابقة وقابلية استنساخ عالية بين التكرارات ، ولكن درجة الحرارة المنخفضة قليلاً أنتجت عائدًا أعلى من المنتج. ب) تم إعداد تفاعلين متطابقين في مزيج مختلف من الكواشف (LuminoCt® SYBR® Green qPCR ReadyMix ™ أو KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix ™) وتشغيل تدرج درجة الحرارة التمهيدي. اختلفت درجة الحرارة المثلى في كل مزيج وكان هناك اختلاف أقل بين البيانات عند تشغيل التفاعلات في كواشف KiCqStart. ج) تم تشغيل اثنين من أزواج التمهيدي لنفس الهدف (KS والمصمم باستخدام Beacon Designer ، BD) في خليط تفاعل مختلف. يمكن ملاحظة أن درجة حرارة التلدين المثلى تختلف في الكواشف المختلفة (61.7 درجة مئوية في LuminoCt و 58.4 درجة مئوية في KiCqStart) للحصول على نتائج مماثلة من البادئات.

على الرغم من أن معظم المقايسات التجارية مزودة بشروط اختبار PCR القياسية ، فقد تستفيد الاختبارات الفردية من مزيد من التحسين لتحديد الشروط الخاصة بمجموعة التمهيدي المعينة. قد يكون هذا بسبب ثنائيات التمهيدي ، أو التضخيم غير المحدد ، أو كفاءة التفاعل دون المستوى الأمثل في ظل الظروف الافتراضية المحددة. عند الانتهاء من التحسين ، يجب حساب كفاءة الاختبار من خلال تطبيق الشروط المختارة لقياس سلسلة من المعايير وإعداد منحنى قياسي (تقييم الفحص). من الممكن ، حتى بعد التحسين ، أن تظل الكفاءة دون المستوى الأمثل ، وفي أسوأ الحالات ، قد تكون هناك حاجة إلى اختبار جديد.

يجب تحديد نطاق قيم الكفاءة المسموح بها من قبل المستخدم قبل بدء عملية التحسين. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون الكفاءة & gt95٪. ومع ذلك ، من الممكن إجراء قياسات دقيقة بمقايسات لها كفاءات & lt90٪ ، وكما هو الحال مع التصميم التمهيدي ، قد يفرض التسلسل المستهدف عدم إمكانية تضخيم الهدف بكفاءة أعلى. ومع ذلك ، عند استخدام اختبار بكفاءة أقل ، فمن المحتمل أن تتأثر الدقة والحد من الاكتشاف. في ظل هذه الظروف ، من الضروري استخدام السلطة التقديرية المناسبة عند تفسير البيانات والإبلاغ عنها 1.


مراجع

Liang، P. & amp Pardee، A.B. العرض التفاضلي للرسول حقيقيات النوى RNA عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل. علم 257, 967–971 (1992).

ليانغ ، ب. عقد من العرض التفاضلي. التقنيات الحيوية 33, 338–346 (2002).

Liang، P. & amp Pardee، A.B. تحليل التعبير الجيني التفاضلي في السرطان. نات. القس السرطان 3, 869–876 (2003).

تشو ، Y.-j. وآخرون. شاشة تفاضلية فلورية متعددة الألوان. التقنيات الحيوية 30, 562–572 (2001).

باور ، د. وآخرون. تحديد أنواع mRNA المعبر عنها تفاضليًا بواسطة تقنية عرض محسنة (DDRT-PCR). الدقة الأحماض النووية. 21, 4272–4280 (1993).

ليانغ ، ب وآخرون. تحليل التعبير الجيني المتغير عن طريق العرض التفاضلي. طرق الانزيم. 254, 304–321 (1995).

ليانغ ، ب وآخرون. عرض تفاضلي باستخدام بادئات oligo-dT مثبتة بقاعدة واحدة. الدقة الأحماض النووية. 22, 5763–5764 (1994).

Liang، P.، Averboukh، L. & amp Pardee، A.B. طريقة العرض التفاضلي. في طرق في علم الوراثة الجزيئية. (ed. Adolph، KW) 3–16 (Academic Press، San Diego، CA، 1994).

Yang، S. & amp Liang، P. التحليل العالمي للتعبير الجيني عن طريق العرض التفاضلي - نموذج رياضي. مول. التكنولوجيا الحيوية. 27, 197–208 (2004).

ميد ، جي دي وآخرون. أتمتة العرض التفاضلي الفلوري مع قراءات رقمية. في طرق وبروتوكولات العرض التفاضلي الطبعة الثانية ، المجلد. 317 (محرران. Liang، P.، Meade، J.D. & amp Pardee، AB) 23–57 (Humana Press، Totowa، NJ، USA، 2005).

Liang، P.، Averboukh، L. & amp Pardee، A.B. توزيع واستنساخ mRNAs حقيقية النواة عن طريق العرض التفاضلي: التحسينات والتحسين. الدقة الأحماض النووية. 21, 3269–3275 (1993).

أوسوبيل ، ف. وآخرون. (محرران) البروتوكولات الحالية في علم الأحياء الجزيئي (جون وايلي وأولاده ، سومرست ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2005).

Zhang ، H. ، Zhang ، R. & amp Liang ، P. الفرز التفاضلي لاختلاف التعبير الجيني المخصب من خلال العرض التفاضلي. الدقة الأحماض النووية. 24, 2454–2455 (1996).

Schena، M.، Shalon، D.، Davis، R.W. & amp Brown، P.O. المراقبة الكمية لأنماط التعبير الجيني باستخدام مصفوفة ميكروأري للحمض النووي التكميلية. علم 270, 467–470 (1995).

تشي ، م وآخرون. الوصول إلى المعلومات الجينية باستخدام مصفوفات الحمض النووي عالية الكثافة. علم 274, 610–614 (1996).

Velculescu، V.E.، Zhang، L.، Vogelstein، B. & amp Kinzler، K.W. التحليل التسلسلي للتعبير الجيني. علم 270, 484–487 (1995).

Liang ، P. اكتشاف الجينات باستخدام العرض التفاضلي. جينيه. م. أخبار 20, 37 (2000).


التأثير والقضايا والمخاطر

ما هو التأثير الذي تشعر أنه يمكن أن يكون لمنتجك؟ (100 كلمة كحد أقصى)

هناك نقص في اختبارات SARS-CoV-2 في جميع أنحاء العالم. هناك حاجة ماسة إلى طرق اختبار جديدة تكون بسيطة وميسورة التكلفة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع. الاعتماد المفرط على هذه التقنية المعقدة للتضخيم الجزيئي يحد من معرفة الأشخاص في العديد من مناطق العالم ما إذا كان الفيروس موجودًا ويعيق جهود الصحة العامة. إذا تمكنا من تحسين طريقة RT-LAMP البسيطة التي تقارن بشكل إيجابي باختبار RT-qPCR الحالي ، فسوف توفر اكتشافًا سريعًا ودقيقًا وفعالًا من حيث التكلفة لـ SARS-CoV-2 والذي يمكن نشره في أي مكان.

ما الذي تعتقد أنه سيجعل مشروعك ناجحًا؟ (100 كلمة كحد أقصى)

النجاح سيكون إنجاز الأهداف التالية:

  1. قم بتطوير إصدار محسن من بروتوكول RT-LAMP من NEB لاكتشاف SARS-CoV-2 يكون حساسًا ومحددًا.
  2. إثبات أنه يمكن استخدام البروتوكول عبر المختبرات ذات الموارد المختلفة ومن قبل الأشخاص الذين لديهم مستويات مختلفة من التدريب السابق على البيولوجيا الجزيئية.
  3. قم بتوثيق العملية والبيانات الناتجة التي أدت إلى 1 & amp 2 أعلاه بطريقة واضحة ويمكن الوصول إليها على JOGL.
  4. قم بإجراء اختبار أولي للطريقة المُحسَّنة على العينات البشرية في مختبر شريك باستخدام تدابير السلامة الحيوية المناسبة ، مما يدل على أنها تؤدي أداءً جيدًا أو أفضل من الطرق المستخدمة حاليًا.

يرجى سرد المشاكل المعروفة ، المخاطر المحتملة ، والمناطق الرمادية ، وما إلى ذلك في مشروعك

- قد يؤدي التحسين باستخدام عناصر التحكم الاصطناعية إلى اختبار لن يعمل بشكل جيد مع عينات المرضى

- بعض الكواشف متوفرة فقط من مصادر فردية ، ونحن بحاجة إلى التخطيط لبدائل مثل الخلطات الرئيسية DIY. قد يكون هذا صحيحًا أيضًا إذا انتهى الأمر بعدم إمكانية الحصول على الحكام أو تكلفتهم كثيرًا لكل اختبار ليكون مفيدًا في المناطق ذات الموارد القليلة.

- قد يكون من المستحيل تحقيق حساسية جيدة عند استخدام العينات الخام دون استخراج الحمض النووي الريبي. إذا كان الأمر كذلك ، فقد نحتاج إلى القطع في طرق تنقية بديلة أو مخازن عينة جديدة.

- قد لا يكون الاختبار قابلاً للشحن بسهولة على الرغم من التقارير التي تفيد بأنه يمكن تجميد هذه الأنواع من الكواشف.


التقنيات الفيزيائية الحيوية للتوصيف الهيكلي للجزيئات الكبيرة

JD Cossar، C.H. اروسميث ، في الفيزياء الحيوية الشاملة ، 2012

1.3.3.2 قالب استنساخ DNA و PCR

يمكن الحصول على قالب DNA لهدف بروتين محدد من مجموعات تجارية أو مجموعات أخرى من نسخ cDNA الفردية أو مكتبات cDNA أو DNA المركب كيميائيًا أو الحمض النووي الجيني (للكائنات التي تحتوي على عدد قليل من الإنترونات أو المجالات المشفرة بواسطة exon واحد). تعد مستنسخات (كدنا) مصدر الاختيار الأول ويتم إنتاجها عن طريق النسخ العكسي من مجموعات الرنا المرسال لخلايا المصدر الأولية (الأنسجة الأصلية). قد تحمل cDNAs متغيرات تسلسلية (إلى حد كونها معيبة) أو تعدد أشكال النوكليوتيدات الفردية ، اعتمادًا على نسيج المصدر. قد تؤدي عملية توليد الحمض النووي من الرنا المرسال أيضًا إلى حدوث طفرات غير مبررة. لذلك ، يجب التحقق من تسلسل قوالب (كدنا) قبل الاستخدام.

إن القدرة على إنتاج الجينات صناعياً موجودة الآن بسهولة في القطاع التجاري والتكنولوجيا قوية نسبيًا. نظرًا لقيود التكلفة والوقت ، فإننا نحتفظ بهذه الإستراتيجية للتسلسلات غير المتوفرة مثل cDNA. يمكن أيضًا تعديل جزيء اصطناعي لاستيعاب تردد استخدام الكودون المفضل للمضيف (الشكل 2). ضمن الكودونات الـ 64 القياسية (تسلسل الحمض النووي الثلاثي المتوافق مع الأحماض الأمينية الفردية في بولي ببتيد) ، من المعروف أن الكائنات الحية المختلفة تظهر استخدامًا متنوعًا حيث يوجد أكثر من كودون واحد لحمض أميني معين (على سبيل المثال ، يحتوي الأرجينين على 6 أكواد مماثلة ، البرولين يحتوي على 4 وسيستين 2 وميثيونين 1). لذلك ، إذا تم التعبير عن البروتين في مضيف غير أصلي ، فمن الممكن مطابقة استخدام الكودون لتسلسل الحمض النووي مع ذلك الخاص بالكائن الحي المضيف. تعتمد الفائدة المحتملة على افتراض أن تقديم كودون نادر (قليل الاستخدام) في مكان غير طبيعي على الرنا المرسال يمكن أن يؤدي إلى توقف الريبوسوم والإنهاء المبكر لاستطالة سلسلة البولي ببتيد. للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة في العوائل البكتيرية ، يمكن التغلب على هذه العوامل غالبًا عن طريق التعبير المشترك مع الحمض الريبي النووي النقال التكميلي للكودونات النادرة. 14 يعتبر وجود الكودونات النادرة أيضًا بمثابة توقف مؤقت في استطالة سلسلة البولي ببتيد الوليدة ، والتي قد تسمح للطي المستقل للمجالات الهيكلية. نظرًا للفائدة غير المؤكدة إلى حد ما لتحسين الكودون ، لا نوصي بهذا النهج في التمريرة الأولى ، ويتم تحضير DNA للقالب الاصطناعي عادةً لتوفير تسلسل الترميز الأصلي.

الشكل 2 . تفضيل استخدام Codon (التحيز) في جينوم H. العاقل, بكتريا قولونية، و S. frugiperda.

غالبًا ما يكون الحمض النووي الجينومي هو الملاذ الأخير في الحالات التي يكون فيها التسلسل كبيرًا بشكل غير مقبول للتوليف ولا يتوفر كـ cDNA. يصعب استخدام الحمض النووي الجيني نسبيًا بسبب التردد المنخفض للتسلسل المستهدف في الجينوم الكلي وما يترتب على ذلك من صعوبة في الحصول على منتج PCR نظيف. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي الحمض النووي الجيني في كثير من الأحيان على إنترونات (DNA غير مشفر داخل الجين المعني) ، والتي يجب إزالتها أثناء عملية بناء الاستنساخ. إن ضرورة التلاعب المتعدد للحصول على الحمض النووي من مادة المصدر الجينومي تزيد حتمًا من خطر إدخال طفرات ضارة (الحذف أو الاستبدالات). لذلك يجب التحقق من تسلسل هذه القوالب قبل استخدامها. بسبب التردد العالي للإنترون ، لا يُعتبر الحمض النووي الجيني للثدييات نموذجًا للاستنساخ. ومع ذلك ، يتم استخدام الحمض النووي المصدر الجيني بشكل روتيني وناجح في مختبرنا كقالب للبروتينات من المتصورة المنجلية 15 والكائنات المماثلة.

بمجرد الحصول على قالب الحمض النووي المطلوب ، يكون من الملائم وضعه في ناقل استنساخ (بلازميد) لغرض التخزين والتلاعب (بما في ذلك الطفرات الموجهة للموقع) والتسلسل واستخدامه كقالب لاستنساخ مناطق معينة من أجل مزيد من المعالجة. عادة ما يتم إجراء مرحلة الحجز هذه في بكتريا قولونية نظرًا لسهولة استخدامها والإخلاص العام في استنساخ إدراج الحمض النووي. تتوفر العديد من الأنظمة ، بما في ذلك سلالة DH5α و pBluescript أو بلازميدات سلسلة Top10. لتجنب المخاوف من سمية المنتج أو التحيز القوي لمعدل النمو للمتغيرات غير المنتجة ، يكون التعبير عن منتج البروتين في حده الأدنى أو غير موجود في مثل هذه الأنظمة.


متعدد أوميك التحليل

التعبير الجيني للدم الكامل

تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي على الدم الذي تم جمعه في أنابيب PAXGene باستخدام مجموعة تنقية PAXGene RNA (QIAGEN) ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة & # x2019s. تم استخدام المحلل الحيوي Agilent 2100 (سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) لتقدير وتقييم جودة إجمالي الحمض النووي الريبي. تم عزل الحمض النووي الريبي متعدد الأدينات باستخدام وحدة العزل المغناطيسي NEBNext Poly (A) mRNA (NEB ، Ipswich ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إنشاء مكتبات (كدنا) من الحمض النووي الريبي متعدد الأدينيلات باستخدام مجموعة إعداد مكتبة KAPA Stranded RNA-Seq (روش ، بازل ، سويسرا). تم تسلسل العينات على HiSeq2500 بقراءات نهاية واحدة بطول 100 نقطة أساس. تم فحص العينات من أجل تأثيرات الدُفعات عبر تحليل خريطة الحرارة لتعداد الجينات الطبيعية ولم يتم العثور على أي منها. تم تقييم جودة تسلسل ملفات fastq باستخدام FastQC v0.11.7 (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). تم إجراء محاذاة القراءات الأولية للجينوم المرجعي باستخدام STAR v2.5.4b (8) لإنشاء ملفات BAM مرتبة حسب الموضع. تم إنشاء فهرس الجينوم المطلوب بواسطة STAR باستخدام الجينوم البشري الذي تم تنزيله من Ensembl (9) ، بناء GRCh38 v91 ، التجميع الأساسي. تم إنشاء تعداد الجينات باستخدام دالة عد htseq من HTSeq v0.10.0 (10). تم تجميع النتائج من البرامج المذكورة أعلاه (FastQC و STAR و HTSeq) في تقرير واحد باستخدام MultiQC v1.0 (11). تم إجراء تحليل بيانات RNA-Seq باستخدام R v3.5.0 (https://www.R-project.org/) و RStudio v1.1.453 (http://www.rstudio.com/). تمت تصفية ملفات العد لإزالة الجينات التي تحتوي على أقل من 10 تهم عبر 15 عينة (عدد التكرارات البيولوجية). تمت إزالة جينات globin المعروفة المقابلة لمعرفات المجموعات الستة التالية: ENSG00000206172 و ENSG00000188536 و ENSG00000244734 و ENSG00000223609 و ENSG00000213934 و ENSG00000196565. بعد التصفية وإزالة الغلوبين ، كان للعينات حجم مكتبة متوسط ​​قدره 4،842،497 ، بحد أدنى 2،217،471 وحد أقصى 14،755،180. تم استخدام DESeq2 v1.20.0 (12) لتحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DE). تم تحديد جينات DE باستخدام اختبار إحصائيات والد ، متبوعًا بالترشيح للأهمية باستخدام عتبة مجمعة للقيمة p المعدلة & # x2264 0.05 وتغييرات الطيات المطلقة & # x2265 1.5. لتحليل إثراء المسار ، تم استخدام Sigora v2.0.1 (13) مع قاعدة بيانات Reactome على مستوى هرمي من أربعة. تم إجراء التصحيح للمقارنات المتعددة باستخدام طريقة Bonferroni ، وتصفية النتائج بناءً على قيمة & # x22640.001.

التحليل الوراثي للدم الكامل

تم استخراج الحمض النووي الجيني (gDNA) من 200 & # x3bcl عينة من الدم الكامل باستخدام DNeasy Blood & amp Tissue Kit (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) باتباع تعليمات الشركة المصنعة & # x2019s. تعرضت سبعمائة وخمسون نانوجرامًا من عينات gDNA الناتجة إلى تحويلات ثنائي سلفيت بين عشية وضحاها باستخدام مجموعة مثيلة EZ DNA (ZymoResearch ، Irvine ، CA) في دورة حرارية PCR (16 دورة من 95 & # xb0C لمدة 30 ثانية ، و 50 & # xb0C لمدة 60 & # xa0 دقيقة ). لأداء التنميط العالمي لميثيل الحمض النووي على رقائق خرطوشة Illumina ، تم استخدام 160 نانوغرام من عينات الحمض النووي المحولة بيسلفيت (bcDNA). بدأ إجراء المصفوفة بتضخيم الجينوم الكامل طوال الليل عند 37 & # xb0C. تم بعد ذلك تجزئة المنتجات التي تم تضخيمها إنزيميًا ، وترسيبها باستخدام الأيزوبروبانول ، ثم إعادة تعليقها في محلول التهجين المؤقت. بعد تمسخ الحرارة ، تم تهجين عينات bcDNA المعالجة على شيبس مثيلة EPIC في حضانة بين عشية وضحاها عند 48 & # xb0C. في اليوم التالي ، تم غسل bcDNA غير المنضم من الرقائق ، ثم تم إجراء تمديد أحادي القاعدة باستخدام dNTPs المسمى DNP والمسمى بالبيوتين. بعد التحييد ، تم تلوين الاشعال الممتد المسمى على كل مجموعة عند 32 & # xb0C في رف الغرفة باستخدام الأجسام المضادة المضادة لـ DNP المسمى Cy5 و Cy3 المسمى streptavidin وفقًا للشركة المصنعة وبروتوكول # x2019s في إجراء تلطيخ لمدة 90 دقيقة. تم بعد ذلك ختم رقائق EPIC الملطخة وتجفيفها ومسحها ضوئيًا باستخدام Illumina iScan على قناة ثنائية اللون لاكتشاف مجسات Cy3 المسمى على القناة الخضراء والتحقيقات المسمى Cy5 على القناة الحمراء. باستخدام حزمة برامج Illumina GenomeStudio ، تم حساب متوسط ​​قيم بيتا عن طريق قسمة شدة إشارة المسبار الميثليلي على مجموع شدة إشارة المسبار الميثيل وغير الميثيل. يتراوح متوسط ​​قيم بيتا من 0 (غير ميثيل تمامًا) إلى 1 (ميثليته بالكامل) ويوفر قراءة كمية لميثيل الحمض النووي النسبي لكل موقع CpG داخل مجموعة الخلايا التي يتم استجوابها. تمت معالجة بيانات مثيلة الحمض النووي (DNAm) أولاً عن طريق التحقق من توزيعات قيمة بيتا في البرنامج الإحصائي R. تم استخدام قيم بيتا لصفيف EPIC لأداء المجموعات الهرمية باستخدام إما صفيف EPIC بأكمله أو قيم تجريبية 58 SNP & # x2019s التجريبية. تم تقييم جودة بيانات الحمض النووي عن طريق ترشيح EPIC وفقًا لهذه المعايير: إذا تم استجواب المجسات ، كان هناك دليل على تهجين متقاطع إلى منطقة من الجينوم بخلاف الهدف المصمم (14) ، كان هناك SNP موجود في هدف CpG أو تمديد قاعدة واحدة للمسبار (تحقيقات متعددة الأشكال) (14). تمت إزالة المجسات إذا كان لديهم عدد خرزي & lt3 في 5٪ من العينات ، أو كان لديهم 1٪ من العينات ذات قيمة p للكشف سيئة و 0.05 gt. تم بعد ذلك تطبيع العينات باستخدام طريقة dasen (15) لتقريب قيمة بيتا معًا. تم إجراء تصحيح لتكوين خلايا الدم في عينات الدم الكاملة باستخدام الانحدار الخطي للعد من تعداد الدم الكامل (16). تمت ملاحظة التأثيرات المجمعة بين معرفات Sentrix باستخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA) وتم استخدام ComBat (17) لتصحيح معرف Sentrix. تم أيضا تقييم البيانات من مكررات التقنية. من أجل تحسين الكفاءة الحسابية وتقليل تصحيح الاختبار المتعدد ، تمت إزالة 101،864 CpGs غير المتغيرة كما هو موضح سابقًا (18). لتحليل البيانات التي تبحث في تأثير التطعيم أو العمر أو الجنس في المجموعة ، تم تشغيل نموذج التأثيرات المختلطة الخطية بقيمة DNAm كنتيجة ، والعوامل الأخرى كآثار رئيسية مع المتغير المشترك لمعرف الموضوع كتأثيرات عشوائية.

التحليل البروتيني والدهني

تم تحليل عينات WBC باستخدام الطرق المنشورة (19). تم قياس البروتينات باستخدام اختبار Pierce & # x2122 Bradford وتم هضم 10 & # x3bcg لكل عينة كما هو موضح سابقًا (20). تمت إزالة الأملاح من الببتيدات باستخدام أطراف استخلاص STop-And-Go (نصائح STAGE) (21) ، وتجفيفها باستخدام Vacufuge Plus (Eppendorf) لمدة 45 و # xa0 دقيقة ، ثم ثنائي الميثيل كيميائيًا باستخدام الفورمالديهايد الخفيف والمتوسط ​​والثقيل (22) للتحليل الثلاثي لـ كل نقطة زمنية لكل فرد (على سبيل المثال ، تم تحضير عينتين ثلاثي الاتجاه لكل فرد ، مع عينة من إحدى النقاط الزمنية المسننة في كلتا العينات ثلاثية الإرسال لاستخدامها كمرجع). بعد وضع العلامات ، تم دمج عينات لكل ثلاثي ، وتحليتها وتجفيفها مرة أخرى باستخدام نصائح STAGE و Vacufuge Plus. تم تعليق الببتيدات في 30 & # x3bcl من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ للكروماتوجرافيا السائلة وتحليل الطيف الكتلي (LC-MS). تم حقن اثنين ميكروغرام لكل عينة في نظام كروماتوغرافيا EasynLC-1000 (Thermo) بعمود تحليلي 50 سم ، معبأ داخليًا بـ C18 ، إلى جانب مطياف الكتلة Impact II Q-TOF (Bruker Daltonics ، بريمن ، ألمانيا) ، مع معلمات مفصلة كما هو موضح سابقًا (23). تم تحليل البيانات باستخدام MaxQuant (الإصدار 1.5.5.1) مع القيم الافتراضية و & # x201cMatch Between Runs & # x201d المنشط ، والبحث في مقابل قاعدة بيانات Uniprot البشرية (تم تنزيلها في 15 يوليو 2017). تم إيداع بيانات بروتيوميات قياس الطيف الكتلي في اتحاد ProteomeXchange Consortium عبر the PRIDE (24) partner repository with the dataset identifier PXD020474.

Plasma lipidomics samples were prepared using a variation of a published protocol (25). Aliquots of 10 μl of plasma were mixed with 180 μl of ammonium bicarbonate (150 mM), followed by extraction with 790 μl of a 7:2 mixture of methyl tert-butyl ether and methanol, respectively. Samples were spiked with 21 μl of internal standard (Table 4). Samples were shaken for 15 min at਄ଌ, and then underwent centrifugation at 3000 × ز for 5 min, from which 100 μl of the organic portion was taken and dried on a 96-well plate each was resuspended in 20 μl of ammonium acetate (7.5 mM) in a 1:2:4 mixture of chloroform, methanol, and isopropanol, respectively. The samples were loaded using the TriVersa NanoMate (Advion, Ithaca, NY, USA) infusion robot and a 4-mm infusion chip, and analyzed by the Impact II Q-TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) in positive and negative ionization mode. Raw data were processed using an in-house script. Batch correction was performed on log2-transformed data using ComBat from the “sva” R package (26). يقترن ر-test was used to test for differentially abundant proteins at each post-vaccination time point (Days 1, 3, 7, and 14) compared to the pre-vaccine time point (Day 0). For comparison of non-responders and responders, a ر-test and multiple-testing correction were applied عبر a custom script in R. For all tests, proteins were filtered for significance using an adjust p-value of 0.05.

الجدول 4 Composition of standards used for analysis of plasma lipidomics.

Immune Cell Phenotyping

Fixed cells were stained per manufacturer recommendations with different labeled antibodies (Table 5) to identify specific cell populations. Flow cytometry data were acquired on a LSRII flow cytometer (BD Biosciences). Flow cytometry raw data were analyzed manually using Flowjo software (version 9.9). In addition, immunophenotyping using automated gating was undertaken on the same samples. This has advantages over manual gating, including increased throughput and identification of specific cell populations with up to 50-dimensional datasets (27). Pre- processing to detect anomalous events obtained during data acquisition was done using the flowCut algorithm (https://rdrr.io/github/jmeskas/flowCut/man/flowCut.htmL). In brief, this approach detects and removes events within time segments for which the fluorescence intensities deviate from the norm. Next, events with either the minimum or maximum value in any of the scatter channels were removed. Singlets were selected using the FSC-A and FCS-W channels. Finally, the data were compensated and transformed using a logical transformation. For each sample, flowDensity (a supervised gating algorithm) (28) was used to determine the thresholds for each marker in each of the biaxial plots in a data-driven manner based on the density distribution of the fluorescence signal. If there were two peaks in the density distribution, the split was located at the minimum between the two peaks. In the case of more than two peaks, the peak-to-peak distance and valley heights was used to determine which split gave the most distinct cut. Otherwise, the algorithm used inflection points. Five challenging populations (live cells, myeloid and plasmacytoid DCs, gamma delta T cells and CD56 bri CD16 lo NK cells) required a second gating step using flowPeaks, an unsupervised clustering algorithm (29). These included populations which were difficult to separate from the background and which could not easily be defined by polygons with sides at pre-defined angles. We defined these cell populations as the union of all of the clusters with centroids inside of the flowDensity-determined boundaries. Cell counts for each of the populations in the gating strategy were obtained and normalized to the bead count, yielding cell counts for a total of 24 immune cell populations (Figure 4). Correlation analysis between antibody titres and cell composition were performed. A Spearman correlation was utilized where antibody data were normally distributed and a Wilcoxon rank sum test when antibody data were skewed.

الجدول 5 Antibody panel for single cell immunophenotyping.


المواد والأساليب

Protein expression and purification

The gene of KmAgo was amplified by PCR from genomic DNA of K. massiliensis JC30 and cloned into the pET28b expression vector in frame with the N-terminal His6-tag using the NheI–XhoI restriction sites. الإشريكية القولونية BL21(DE3) was transformed with the expression plasmid and the cells were cultivated in the LB medium with 50 μg/ml kanamycin at 25ଌ until OD600 = 0.4, cooled down to 16ଌ, induced with 0.2 mM IPTG and grown at 16ଌ overnight with aeration. The cells were collected by centrifugation and stored at �ଌ. The cell pellet was resuspended in buffer A (30 mM Tris–HCl pH 7.9, 0.3 M NaCl, 5% glycerol) supplemented with 1 mM of PMSF and disrupted using Cell Disruptor CF (Constant Systems). The lysate was cleared by centrifugation, and loaded onto Co 2+ -charged TALON Metal Affinity Resin (Clontech) for 1.5 h with agitation. The beads were washed with buffer A containing 5 mM of imidazole, then with the same buffer with 20 mM of imidazole, and eluted with buffer containing 300 mM imidazole. The eluted protein was diluted 3-fold with a buffer containing 20 mM Tris–HCl pH 7.9 and 5% glycerol. The protein sample was loaded onto a Heparin FF column (GE Healthcare) equilibrated with 20 mM Tris–HCl pH 7.9, 100 mM NaCl and 5% glycerol, washed with 10 volumes of the same buffer and eluted with a linear NaCl gradient (0.1𠄱.0 M). The purity of the final protein samples was assessed by denaturing PAGE with Coomassie staining. Fractions containing KmAgo were concentrated using Amicon Ultra 50K (Merck Millipore), placed in a storage buffer (40 mM Tris–HCl, 0.3 M NaCl, 50% glycerol, 1 mM DTT, 0.5 mM EDTA, pH 7.9), aliquoted and frozen in liquid nitrogen. The protein concentration was determined by the Qubit protein assay kit (Thermo Fischer Scientific). Catalytically dead mutant variant (D527A D596A) was obtained by site-directed mutagenesis using QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent), expressed and purified in the same way.

Analysis of KmAgo-associated smDNAs

Small nucleic acids were extracted by phenol-chloroform treatment from KmAgo after the first purification step (Co 2+ -resin). Nucleic acids were treated with DNase I or RNase A and analyzed by denaturing PAGE as described previously (15). Small DNA libraries were prepared as described in (16). Briefly, extracted nucleic acids were ethanol-precipitated, treated with RNase A (ThermoFisher), ligated with adaptor oligonucleotides and sequenced using the HiSeq2500 platform (Illumina) in the rapid run mode (50-nucleotide single-end reads). Analysis of smDNA sequences was performed as described previously (16).

Analysis of cell growth

Overnight culture prepared from بكتريا قولونية BL21(DE3) transformed with the expression plasmid pET28-KmAgo or the empty vector was diluted to OD 0.015 in the LB medium containing 50 μg/ml kanamycin and 0.2 mM IPTG or 0.2% glucose and aliquoted in a 24-well plate, 1 ml per well. The plate was incubated at 30ଌ with agitation at 200 rpm and OD was measured each 10 min in a Tecan microplate reader. Data from three independent biological replicates were used to plot the growth curves.

Single strand nucleic acid cleavage

The cleavage assays were performed using synthetic guide and target DNAs and RNAs (see Supplementary Table S1 for oligonucleotide sequences). For some experiments 5′-Cy3- or 5′- 32 P-labeled targets were used. The 6S RNA gene was PCR-amplified from the genomic DNA of بكتريا قولونية strain MG1655 including the T7 RNA polymerase promoter in the forward primer. 6S RNA was synthesized by T7 RNA polymerase (Thermo Fisher Scientific), purified by 8% denaturing PAGE, treated with DNase I and ethanol precipitated. The cleavage reactions were performed in low adhesion tubes at 37ଌ in a buffer containing 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 10% glycerol and 10 mM MnCl2. To analyze the effect of various divalent cations 10 mM MgCl2, CoCl2, CuCl2 or ZnCl2 were added instead of MnCl2. 500 nM of KmAgo was mixed with 500 nM guide DNA or RNA and incubated for 10 min at 37ଌ for guide loading. All guides were 5′-phosphorylated using T4 PNK (New England Biolabs) except for experiments with 5′-OH guides. Target DNA or RNA was then added to the final concentration of 100 nM. For analysis of temperature dependence of ssDNA cleavage, KmAgo was loaded with guide DNA for 10 min at 37ଌ, the samples were transferred to indicated temperatures in a dry block heater (BioSan, CH-100), target DNA or RNA was added and the samples were incubated for 4 minutes with G-DNA and T-DNA, 40 min with G-DNA and T-RNA and 60 minutes for G-RNA with T-DNA or T-RNA. For experiments on multiple turnover cleavage (Supplementary Figure S4A), an excess of target DNA (200 nM) was incubated with 100 nM KmAgo-guide complex (equimolar KmAgo and guide ratio) at 37ଌ or 60ଌ. For experiments in Supplementary Figure S4B, 50 or 100 nM of the KmAgo-guide complex was incubated for 30 min with 200 nM of label-free target DNA and then 5′-Cy3 labeled target DNA was added to 200 nM concentration. For analysis of 6S RNA cleavage, the reactions were performed for 30 minutes with corresponding DNA guides. All reactions were carried out at 37 or 60ଌ as indicated. The reactions were stopped after indicated time intervals by mixing the samples with equal volumes of stop solution (8 M urea, 20 mM EDTA, 0.005% Bromophenol Blue, 0.005% Xylene Cyanol). The cleavage products were resolved by 19% denaturing PAGE, stained with SYBR Gold (Invitrogen) or visualized with a Typhoon FLA 9500 scanner (GE Healthcare) in the case of 5'- 32 P-labeled targets, and analyzed by the ImageQuant (GE Healthcare) software. For reactions containing Cy3-labels, the gels with the reaction products were first scanned in the Cy3 channel and then stained with SYBR Gold. In the case of 6S RNA, the cleavage products were resolved by 10% denaturing PAGE and stained with SYBR Gold.

Plasmid DNA cleavage

For analysis of plasmid DNA cleavage, the final pAgo and guide concentrations were 500 nM. When using two or four guide molecules, the samples of KmAgo were independently loaded with the guides (at the 1:1 KmAgo:guide ratio) and then mixed together to the final concentration of 500 nM. The sequences of all guide oligonucleotides are shown in Supplementary Table S1. The target plasmids used in the assays are pJET1.2 derivatives (Thermo Fisher Scientific) containing short inserts shown in Supplementary Table S1. The plasmid was added to the reaction mixtures to the final concentration of 2 nM, followed by incubation for indicated time intervals at 37 or 60ଌ. SSB proteins (بكتريا قولونية SSB purified as described before (6) or thermostable ET SSB purchased from New England BioLabs) were added to the reaction mixtures to the final concentration of 1 μM 10 min prior to the addition of KmAgo, when indicated. The reactions were stopped by treatment with Proteinase K for 20 min at 25ଌ, the samples were mixed with 6× SDS-free Purple Loading Dye (New England Biolabs) supplemented with SYBR Gold and the cleavage products were resolved by native 1.2% agarose gel electrophoresis. The relaxed plasmid in control samples was generated by treatment of the supercoiled plasmid with RNase H2 (New England Biolabs) for 2 h at 37ଌ, the linear plasmid was obtained by treatment with a single cut restriction endonuclease (XhoI, Thermo Fisher Scientific).


يسلط الضوء

  1. Characterization of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-induced mutant alleles and fluorescent protein reporter constructs of entire MIR172 أسرة.
  2. microRNA172 activity at the shoot apical meristem (SAM) is crucially important for floral transition under short-day (SD) conditions.
  3. Coordinated transcriptional and posttranscriptional mechanisms repress the activity of APETALA2-LIKE (AP2-LIKE) transcription factors (TFs) during flowering.

12.2 Visualizing and Characterizing DNA, RNA, and Protein

The sequence of a DNA molecule can help us identify an organism when compared to known sequences housed in a database. The sequence can also tell us something about the function of a particular part of the DNA, such as whether it encodes a particular protein. Comparing protein signatures —the expression levels of specific arrays of proteins—between samples is an important method for evaluating cellular responses to a multitude of environmental factors and stresses. Analysis of protein signatures can reveal the identity of an organism or how a cell is responding during disease.

The DNA and proteins of interest are microscopic and typically mixed in with many other molecules including DNA or proteins irrelevant to our interests. Many techniques have been developed to isolate and characterize molecules of interest. These methods were originally developed for research purposes, but in many cases they have been simplified to the point that routine clinical use is possible. For example, many pathogens, such as the bacterium هيليكوباكتر بيلوري , which causes stomach ulcers , can be detected using protein-based tests. In addition, an increasing number of highly specific and accurate DNA amplification-based identification assays can now detect pathogens such as antibiotic-resistant enteric bacteria, herpes simplex virus , varicella-zoster virus , and many others.

Molecular Analysis of DNA

In this subsection, we will outline some of the basic methods used for separating and visualizing specific fragments of DNA that are of interest to a scientist. Some of these methods do not require knowledge of the complete sequence of the DNA molecule. Before the advent of rapid DNA sequencing, these methods were the only ones available to work with DNA, but they still form the basic arsenal of tools used by molecular geneticists to study the body’s responses to microbial and other diseases.

Nucleic Acid Probing

DNA molecules are small, and the information contained in their sequence is invisible. How does a researcher isolate a particular stretch of DNA, or having isolated it, determine what organism it is from, what its sequence is, or what its function is? One method to identify the presence of a certain DNA sequence uses artificially constructed pieces of DNA called probes. Probes can be used to identify different bacterial species in the environment and many DNA probes are now available to detect pathogens clinically. For example, DNA probes are used to detect the vaginal pathogens المبيضات البيض , Gardnerella vaginalis ، و المشعرات المهبلية .

To screen a genomic library for a particular gene or sequence of interest, researchers must know something about that gene. If researchers have a portion of the sequence of DNA for the gene of interest, they can design a DNA probe , a single-stranded DNA fragment that is complementary to part of the gene of interest and different from other DNA sequences in the sample. The DNA probe may be synthesized chemically by commercial laboratories, or it may be created by cloning, isolating, and denaturing a DNA fragment from a living organism. In either case, the DNA probe must be labeled with a molecular tag or beacon, such as a radioactive phosphorus atom (as is used for autoradiography ) or a fluorescent dye (as is used in fluorescent فى الموقع hybridization, or FISH), so that the probe and the DNA it binds to can be seen (Figure 12.13). The DNA sample being probed must also be denatured to make it single-stranded so that the single-stranded DNA probe can anneal to the single-stranded DNA sample at locations where their sequences are complementary. While these techniques are valuable for diagnosis, their direct use on sputum and other bodily samples may be problematic due to the complex nature of these samples. DNA often must first be isolated from bodily samples through chemical extraction methods before a DNA probe can be used to identify pathogens.

Clinical Focus

الجزء 2

The mild, flu-like symptoms that Kayla is experiencing could be caused by any number of infectious agents. In addition, several non-infectious autoimmune conditions, such as multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus (SLE), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS), also have symptoms that are consistent with Kayla’s early symptoms. However, over the course of several weeks, Kayla’s symptoms worsened. She began to experience joint pain in her knees, heart palpitations, and a strange limpness in her facial muscles. In addition, she suffered from a stiff neck and painful headaches. Reluctantly, she decided it was time to seek medical attention.

  • Do Kayla’s new symptoms provide any clues as to what type of infection or other medical condition she may have?
  • What tests or tools might a health-care provider use to pinpoint the pathogen causing Kayla’s symptoms?

Jump to the next Clinical Focus box. Go back to the previous Clinical Focus box.

Agarose Gel Electrophoresis

There are a number of situations in which a researcher might want to physically separate a collection of DNA fragments of different sizes. A researcher may also digest a DNA sample with a restriction enzyme to form fragments. The resulting size and fragment distribution pattern can often yield useful information about the sequence of DNA bases that can be used, much like a bar-code scan, to identify the individual or species to which the DNA belongs.

Gel electrophoresis is a technique commonly used to separate biological molecules based on size and biochemical characteristics, such as charge and polarity. Agarose gel electrophoresis is widely used to separate DNA (or RNA) of varying sizes that may be generated by restriction enzyme digestion or by other means, such as the PCR (Figure 12.14).

Due to its negatively charged backbone, DNA is strongly attracted to a positive electrode. In agarose gel electrophoresis, the gel is oriented horizontally in a buffer solution. Samples are loaded into sample wells on the side of the gel closest to the negative electrode, then drawn through the molecular sieve of the agarose matrix toward the positive electrode. The agarose matrix impedes the movement of larger molecules through the gel, whereas smaller molecules pass through more readily. Thus, the distance of migration is inversely correlated to the size of the DNA fragment, with smaller fragments traveling a longer distance through the gel. Sizes of DNA fragments within a sample can be estimated by comparison to fragments of known size in a DNA ladder also run on the same gel. To separate very large DNA fragments, such as chromosomes or viral genomes, agarose gel electrophoresis can be modified by periodically alternating the orientation of the electric field during pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) . In PFGE , smaller fragments can reorient themselves and migrate slightly faster than larger fragments and this technique can thus serve to separate very large fragments that would otherwise travel together during standard agarose gel electrophoresis. In any of these electrophoresis techniques, the locations of the DNA or RNA fragments in the gel can be detected by various methods. One common method is adding ethidium bromide , a stain that inserts into the nucleic acids at non-specific locations and can be visualized when exposed to ultraviolet light. Other stains that are safer than ethidium bromide, a potential carcinogen, are now available.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Analysis

Restriction enzyme recognition sites are short (only a few nucleotides long), sequence-specific palindromes, and may be found throughout the genome. Thus, differences in DNA sequences in the genomes of individuals will lead to differences in distribution of restriction-enzyme recognition sites that can be visualized as distinct banding patterns on a gel after agarose gel electrophoresis. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis compares DNA banding patterns of different DNA samples after restriction digestion (Figure 12.15).

RFLP analysis has many practical applications in both medicine and forensic science . For example, epidemiologists use RFLP analysis to track and identify the source of specific microorganisms implicated in outbreaks of food poisoning or certain infectious diseases. RFLP analysis can also be used on human DNA to determine inheritance patterns of chromosomes with variant genes, including those associated with heritable diseases or to establish paternity .

Forensic scientists use RFLP analysis as a form of DNA fingerprinting , which is useful for analyzing DNA obtained from crime scenes, suspects, and victims. DNA samples are collected, the numbers of copies of the sample DNA molecules are increased using PCR , and then subjected to restriction enzyme digestion and agarose gel electrophoresis to generate specific banding patterns. By comparing the banding patterns of samples collected from the crime scene against those collected from suspects or victims, investigators can definitively determine whether DNA evidence collected at the scene was left behind by suspects or victims.

Southern Blots and Modifications

Several molecular techniques capitalize on sequence complementarity and hybridization between nucleic acids of a sample and DNA probes. Typically, probing nucleic-acid samples within a gel is unsuccessful because as the DNA probe soaks into a gel, the sample nucleic acids within the gel diffuse out. Thus, blotting techniques are commonly used to transfer nucleic acids to a thin, positively charged membrane made of nitrocellulose or nylon. In the Southern blot technique, developed by Sir Edwin Southern in 1975, DNA fragments within a sample are first separated by agarose gel electrophoresis and then transferred to a membrane through capillary action (Figure 12.16). The DNA fragments that bind to the surface of the membrane are then exposed to a specific single-stranded DNA probe labeled with a radioactive or fluorescent molecular beacon to aid in detection. Southern blots may be used to detect the presence of certain DNA sequences in a given DNA sample. Once the target DNA within the membrane is visualized, researchers can cut out the portion of the membrane containing the fragment to recover the DNA fragment of interest.

Variations of the Southern blot—the dot blot, slot blot, and the spot blot—do not involve electrophoresis, but instead concentrate DNA from a sample into a small location on a membrane. After hybridization with a DNA probe, the signal intensity detected is measured, allowing the researcher to estimate the amount of target DNA present within the sample.

A colony blot is another variation of the Southern blot in which colonies representing different clones in a genomic library are transferred to a membrane by pressing the membrane onto the culture plate. The cells on the membrane are lysed and the membrane can then be probed to determine which colonies within a genomic library harbor the target gene. Because the colonies on the plate are still growing, the cells of interest can be isolated from the plate.

In the northern blot , another variation of the Southern blot, RNA (not DNA) is immobilized on the membrane and probed. Northern blots are typically used to detect the amount of mRNA made through gene expression within a tissue or organism sample.

Microarray Analysis

Another technique that capitalizes on the hybridization between complementary nucleic acid sequences is called microarray analysis . Microarray analysis is useful for the comparison of gene-expression patterns between different cell types—for example, cells infected with a virus versus uninfected cells, or cancerous cells versus healthy cells (Figure 12.17).

Typically, DNA or cDNA from an experimental sample is deposited on a glass slide alongside known DNA sequences. Each slide can hold more than 30,000 different DNA fragment types. Distinct DNA fragments (encompassing an organism’s entire genomic library) or cDNA fragments (corresponding to an organism’s full complement of expressed genes) can be individually spotted on a glass slide.

Once deposited on the slide, genomic DNA or mRNA can be isolated from the two samples for comparison. If mRNA is isolated, it is reverse-transcribed to cDNA using reverse transcriptase. Then the two samples of genomic DNA or cDNA are labeled with different fluorescent dyes (typically red and green). The labeled genomic DNA samples are then combined in equal amounts, added to the microarray chip, and allowed to hybridize to complementary spots on the microarray.

Hybridization of sample genomic DNA molecules can be monitored by measuring the intensity of fluorescence at particular spots on the microarray. Differences in the amount of hybridization between the samples can be readily observed. If only one sample’s nucleic acids hybridize to a particular spot on the microarray, then that spot will appear either green or red. However, if both samples’ nucleic acids hybridize, then the spot will appear yellow due to the combination of the red and green dyes.

Although microarray technology allows for a holistic comparison between two samples in a short time, it requires sophisticated (and expensive) detection equipment and analysis software. Because of the expense, this technology is typically limited to research settings. Researchers have used microarray analysis to study how gene expression is affected in organisms that are infected by bacteria or viruses or subjected to certain chemical treatments.

ارتباط بالتعلم

Explore microchip technology at this interactive website.

Check Your Understanding

  • What does a DNA probe consist of?
  • Why is a Southern blot used after gel electrophoresis of a DNA digest?

Molecular Analysis of Proteins

In many cases it may not be desirable or possible to study DNA or RNA directly. Proteins can provide species-specific information for identification as well as important information about how and whether a cell or tissue is responding to the presence of a pathogenic microorganism. Various proteins require different methods for isolation and characterization.

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

A variation of gel electrophoresis, called polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) , is commonly used for separating proteins. In PAGE , the gel matrix is finer and composed of polyacrylamide instead of agarose. Additionally, PAGE is typically performed using a vertical gel apparatus (Figure 12.18). Because of the varying charges associated with amino acid side chains, PAGE can be used to separate intact proteins based on their net charges. Alternatively, proteins can be denatured and coated with a negatively charged detergent called sodium dodecyl sulfate (SDS) , masking the native charges and allowing separation based on size only. PAGE can be further modified to separate proteins based on two characteristics, such as their charges at various pHs as well as their size, through the use of two-dimensional PAGE . In any of these cases, following electrophoresis, proteins are visualized through staining, commonly with either Coomassie blue or a silver stain.

Check Your Understanding

Clinical Focus

الجزء 3

When Kayla described her symptoms, her physician at first suspected bacterial meningitis , which is consistent with her headaches and stiff neck. However, she soon ruled this out as a possibility because meningitis typically progresses more quickly than what Kayla was experiencing. Many of her symptoms still paralleled those of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and systemic lupus erythematosus (SLE) , and the physician also considered Lyme disease a possibility given how much time Kayla spends in the woods. Kayla did not recall any recent tick bites (the typical means by which Lyme disease is transmitted) and she did not have the typical bull’s-eye rash associated with Lyme disease (Figure 12.19). However, 20–30% of patients with Lyme disease never develop this rash, so the physician did not want to rule it out.

Kayla’s doctor ordered an MRI of her brain, a complete blood count to test for anemia, blood tests assessing liver and kidney function, and additional tests to confirm or rule out SLE or Lyme disease. Her test results were inconsistent with both SLE and ALS, and the result of the test looking for Lyme disease antibodies was “equivocal,” meaning inconclusive. Having ruled out ALS and SLE, Kayla’s doctor decided to run additional tests for Lyme disease.

  • Why would Kayla’s doctor still suspect Lyme disease even if the test results did not detect Lyme antibodies in the blood?
  • What type of molecular test might be used for the detection of blood antibodies to Lyme disease?

Jump to the next Clinical Focus box. Go back to the previous Clinical Focus box.

Amplification-Based DNA Analysis Methods

Various methods can be used for obtaining sequences of DNA, which are useful for studying disease-causing organisms. With the advent of rapid sequencing technology, our knowledge base of the entire genomes of pathogenic organisms has grown phenomenally. We start with a description of the polymerase chain reaction, which is not a sequencing method but has allowed researchers and clinicians to obtain the large quantities of DNA needed for sequencing and other studies. The polymerase chain reaction eliminates the dependence we once had on cells to make multiple copies of DNA, achieving the same result through relatively simple reactions outside the cell.

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

Most methods of DNA analysis, such as restriction enzyme digestion and agarose gel electrophoresis, or DNA sequencing require large amounts of a specific DNA fragment. In the past, large amounts of DNA were produced by growing the host cells of a genomic library. However, libraries take time and effort to prepare and DNA samples of interest often come in minute quantities. The polymerase chain reaction (PCR) permits rapid amplification in the number of copies of specific DNA sequences for further analysis (Figure 12.20). One of the most powerful techniques in molecular biology, PCR was developed in 1983 by Kary Mullis while at Cetus Corporation. PCR has specific applications in research, forensic, and clinical laboratories, including:

  • determining the sequence of nucleotides in a specific region of DNA
  • amplifying a target region of DNA for cloning into a plasmid vector
  • identifying the source of a DNA sample left at a crime scene
  • analyzing samples to determine paternity
  • comparing samples of ancient DNA with modern organisms
  • determining the presence of difficult to culture, or unculturable, microorganisms in humans or environmental samples

PCR is an في المختبر laboratory technique that takes advantage of the natural process of DNA replication. The heat-stable DNA polymerase enzymes used in PCR are derived from hyperthermophilic prokaryotes. Taq DNA polymerase , commonly used in PCR, is derived from the Thermus aquaticus bacterium isolated from a hot spring in Yellowstone National Park. DNA replication requires the use of primers for the initiation of replication to have free 3ʹ-hydroxyl groups available for the addition of nucleotides by DNA polymerase. However, while primers composed of RNA are normally used in cells, DNA primers are used for PCR. DNA primers are preferable due to their stability, and DNA primers with known sequences targeting a specific DNA region can be chemically synthesized commercially. These DNA primers are functionally similar to the DNA probes used for the various hybridization techniques described earlier, binding to specific targets due to complementarity between the target DNA sequence and the primer.

PCR occurs over multiple cycles, each containing three steps: denaturation , annealing , and extension. Machines called thermal cycler s are used for PCR these machines can be programmed to automatically cycle through the temperatures required at each step (Figure 12.1). First, double-stranded template DNA containing the target sequence is denatured at approximately 95 °C. The high temperature required to physically (rather than enzymatically) separate the DNA strands is the reason the heat-stable DNA polymerase is required. Next, the temperature is lowered to approximately 50 °C. This allows the DNA primers complementary to the ends of the target sequence to anneal (stick) to the template strands, with one primer annealing to each strand. Finally, the temperature is raised to 72 °C, the optimal temperature for the activity of the heat-stable DNA polymerase, allowing for the addition of nucleotides to the primer using the single-stranded target as a template. Each cycle doubles the number of double-stranded target DNA copies. Typically, PCR protocols include 25–40 cycles, allowing for the amplification of a single target sequence by tens of millions to over a trillion.

Natural DNA replication is designed to copy the entire genome, and initiates at one or more origin sites. Primers are constructed during replication, not before, and do not consist of a few specific sequences. PCR targets specific regions of a DNA sample using sequence-specific primers. In recent years, a variety of isothermal PCR amplification methods that circumvent the need for thermal cycling have been developed, taking advantage of accessory proteins that aid in the DNA replication process. As the development of these methods continues and their use becomes more widespread in research, forensic, and clinical labs, thermal cyclers may become obsolete.

ارتباط بالتعلم

Deepen your understanding of the polymerase chain reaction by viewing this animation and working through an interactive exercise.

PCR Variations

Several later modifications to PCR further increase the utility of this technique. Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) is used for obtaining DNA copies of a specific mRNA molecule. RT-PCR begins with the use of the reverse transcriptase enzyme to convert mRNA molecules into cDNA . That cDNA is then used as a template for traditional PCR amplification. RT-PCR can detect whether a specific gene has been expressed in a sample. Another recent application of PCR is real-time PCR , also known as quantitative PCR (qPCR) . Standard PCR and RT-PCR protocols are not quantitative because any one of the reagents may become limiting before all of the cycles within the protocol are complete, and samples are only analyzed at the end. Because it is not possible to determine when in the PCR or RT-PCR protocol a given reagent has become limiting, it is not possible to know how many cycles were completed prior to this point, and thus it is not possible to determine how many original template molecules were present in the sample at the start of PCR. In qPCR, however, the use of fluorescence allows one to monitor the increase in a double-stranded template during a PCR reaction as it occurs. These kinetics data can then be used to quantify the amount of the original target sequence. The use of qPCR in recent years has further expanded the capabilities of PCR, allowing researchers to determine the number of DNA copies, and sometimes organisms, present in a sample. In clinical settings, qRT-PCR is used to determine viral load in HIV-positive patients to evaluate the effectiveness of their therapy.

DNA Sequencing

A basic sequencing technique is the chain termination method , also known as the dideoxy method or the Sanger DNA sequencing method , developed by Frederick Sanger in 1972. The chain termination method involves DNA replication of a single-stranded template with the use of a DNA primer to initiate synthesis of a complementary strand, DNA polymerase, a mix of the four regular deoxynucleotide (dNTP) monomers, and a small proportion of dideoxynucleotides (ddNTPs), each labeled with a molecular beacon . The ddNTPs are monomers missing a hydroxyl group (–OH) at the site at which another nucleotide usually attaches to form a chain (Figure 12.21). Every time a ddNTP is randomly incorporated into the growing complementary strand, it terminates the process of DNA replication for that particular strand. This results in multiple short strands of replicated DNA that are each terminated at a different point during replication. When the reaction mixture is subjected to gel electrophoresis, the multiple newly replicated DNA strands form a ladder of differing sizes. Because the ddNTPs are labeled, each band on the gel reflects the size of the DNA strand when the ddNTP terminated the reaction.

In Sanger’s day, four reactions were set up for each DNA molecule being sequenced, each reaction containing only one of the four possible ddNTPs. Each ddNTP was labeled with a radioactive phosphorus molecule. The products of the four reactions were then run in separate lanes side by side on long, narrow PAGE gels, and the bands of varying lengths were detected by autoradiography. Today, this process has been simplified with the use of ddNTPs, each labeled with a different colored fluorescent dye or fluorochrome (Figure 12.22), in one sequencing reaction containing all four possible ddNTPs for each DNA molecule being sequenced (Figure 12.23). These fluorochromes are detected by fluorescence spectroscopy. Determining the fluorescence color of each band as it passes by the detector produces the nucleotide sequence of the template strand.

Since 2005, automated sequencing techniques used by laboratories fall under the umbrella of next generation sequencing , which is a group of automated techniques used for rapid DNA sequencing. These methods have revolutionized the field of molecular genetics because the low-cost sequencers can generate sequences of hundreds of thousands or millions of short fragments (25 to 600 base pairs) just in one day. Although several variants of next generation sequencing technologies are made by different companies (for example, 454 Life Sciences’ pyrosequencing and Illumina’s Solexa technology), they all allow millions of bases to be sequenced quickly, making the sequencing of entire genomes relatively easy, inexpensive, and commonplace. In 454 sequencing (pyrosequencing) , for example, a DNA sample is fragmented into 400–600-bp single-strand fragments, modified with the addition of DNA adapters to both ends of each fragment. Each DNA fragment is then immobilized on a bead and amplified by PCR, using primers designed to anneal to the adapters, creating a bead containing many copies of that DNA fragment. Each bead is then put into a separate well containing sequencing enzymes. To the well, each of the four nucleotides is added one after the other when each one is incorporated, pyrophosphate is released as a byproduct of polymerization, emitting a small flash of light that is recorded by a detector. This provides the order of nucleotides incorporated as a new strand of DNA is made and is an example of synthesis sequencing. Next generation sequencers use sophisticated software to get through the cumbersome process of putting all the fragments in order. Overall, these technologies continue to advance rapidly, decreasing the cost of sequencing and increasing the availability of sequence data from a wide variety of organisms quickly.

The National Center for Biotechnology Information houses a widely used genetic sequence database called GenBank where researchers deposit genetic information for public use. Upon publication of sequence data, researchers upload it to GenBank, giving other researchers access to the information. The collaboration allows researchers to compare newly discovered or unknown sample sequence information with the vast array of sequence data that already exists.

ارتباط بالتعلم

View an animation about 454 sequencing to deepen your understanding of this method.

Case in Point

Using a NAAT to Diagnose a C. difficile عدوى

Javier, an 80-year-old patient with a history of heart disease, recently returned home from the hospital after undergoing an angioplasty procedure to insert a stent into a cardiac artery. To minimize the possibility of infection, Javier was administered intravenous broad-spectrum antibiotics during and shortly after his procedure. He was released four days after the procedure, but a week later, he began to experience mild abdominal cramping and watery diarrhea several times a day. He lost his appetite, became severely dehydrated, and developed a fever. He also noticed blood in his stool. Javier’s wife called the physician, who instructed her to take him to the emergency room immediately.

The hospital staff ran several tests and found that Javier’s kidney creatinine levels were elevated compared with the levels in his blood, indicating that his kidneys were not functioning well. Javier’s symptoms suggested a possible infection with المطثية العسيرة , a bacterium that is resistant to many antibiotics. The hospital collected and cultured a stool sample to look for the production of toxins A and B by C. difficile, but the results came back negative. However, the negative results were not enough to rule out a C. difficile infection because culturing of C. difficile and detection of its characteristic toxins can be difficult, particularly in some types of samples. To be safe, they proceeded with a diagnostic nucleic acid amplification test (NAAT). Currently NAATs are the clinical diagnostician’s gold standard for detecting the genetic material of a pathogen. In Javier’s case, qPCR was used to look for the gene encoding C. difficile toxin B (tcdB). When the qPCR analysis came back positive, the attending physician concluded that Javier was indeed suffering from a C. difficile infection and immediately prescribed the antibiotic vancomycin , to be administered intravenously. The antibiotic cleared the infection and Javier made a full recovery.

Because infections with C. difficile were becoming widespread in Javier’s community, his sample was further analyzed to see whether the specific strain of C. difficile could be identified. Javier’s stool sample was subjected to ribotyping and repetitive sequence-based PCR (rep-PCR) analysis. In ribotyping, a short sequence of DNA between the 16S rRNA and 23S rRNA genes is amplified and subjected to restriction digestion (Figure 12.24). This sequence varies between strains of C. difficile, so restriction enzymes will cut in different places. In rep-PCR, DNA primers designed to bind to short sequences commonly found repeated within the C. difficile genome were used for PCR. Following restriction digestion, agarose gel electrophoresis was performed in both types of analysis to examine the banding patterns that resulted from each procedure (Figure 12.25). Rep-PCR can be used to further subtype various ribotypes, increasing resolution for detecting differences between strains. The ribotype of the strain infecting Javier was found to be ribotype 27, a strain known for its increased virulence, resistance to antibiotics, and increased prevalence in the United States, Canada, Japan, and Europe. 4


شاهد الفيديو: DNA FINGERPRINTS. بصمة الحمض النووي. بيولوجيا بيناتنا. الحلقة 1. شنو هاذ العجب (أغسطس 2022).