معلومة

12.5: تمرين 1 - تحول الخميرة - علم الأحياء

12.5: تمرين 1 - تحول الخميرة - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

البروتوكول التالي هو تعديل طفيف لبروتوكول التحويل "السريع والقذر" الذي وصفه Amberg وآخرون. (2005). يمكن أن تزيد التعديلات على هذه الطريقة من كفاءتها بعدة أوامر من حيث الحجم (Gietz and Schiestl ، 2007) ، والتي ستكون مطلوبة إذا تم استخدام قطع خطية من الحمض النووي لتحويل الخميرة.

قم بإعداد مزيج رئيسي للتحول

1. قم بإعداد مزيج رئيسي للتحول. توفر المكونات التالية كواشف كافية لخمسة تفاعلات تحول. يُمزج ويُخلط في أنبوب الطرد المركزي الدقيق:

100 ميكرولتر معقمة 2 م أسيتات الليثيوم (طازجة)
400 ميكرولتر معقمة 50٪ بيج -3350
4 ميكرولتر 2-مركابتوإيثانول (ستينكي !! أضف هذا في غطاء الدخان!)

قم بإعداد تفاعلات التحول الفردية - لكل تحويل:

2. إضافة 15 ميكرولتر من الحمض النووي للحيوانات المنوية لسمك السلمون المشوه (2 مجم / مل) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديدالمسمىباسم (أو رمز) البلازميد.

ملحوظة: من المهم أن يكون الحمض النووي للحيوانات المنوية من سمك السلمون منفردًا حتى يعمل هذا الإجراء بشكل جيد. غلي الحمض النووي لمدة 5 دقائق لتفسد الحمض النووي. قم بتبريد الحمض النووي سريعًا عن طريق وضعه على الجليد فورًا. احتفظ بالحمض النووي على الجليد حتى تكون جاهزًا لاستخدامه.

3. أضف 5 ميكرولتر من DNA البلازميد miniprep إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى بشكل مناسب.

4. إضافة 100 ميكرولتر من مزيج التحول من الخطوة 1 إلى كل أنبوب ميكروسينتريفوجي. دوامة لمدة 10-15 ثانية لخلط المحتويات.

5. باستخدام مسواك معقم أو طرف الماصة المجهرية ، اكشط مستعمرة خميرة كبيرة (أو ما يعادل "رأس مطابقة" من الخميرة) من صفيحة YPD. نقل الخميرة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على محلول التحول / الحمض النووي (الخطوة 4) عن طريق تدوير المسواك عدة مرات. تأكد من تعليق الخلايا بشكل موحد قبل المتابعة.

كرر الخطوات من 2 إلى 5 لكل تفاعل من تفاعلات التحويل. تأكد من تضمين عنصر تحكم لا يحتوي على DNA البلازميد.

6. احتضان مخاليط التحويل عند 37 درجة مئوية مع رجها لمدة 30-45 دقيقة.

صفيحة الخلايا المحولة على وسائط انتقائية تفتقر إلى اليوراسيل.

7. إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا المعلقة وإضافتها إلى 90 ميكرولتر من الماء المعقم في أنبوب ميكروسينتريفوجي. سيتم تخفيف هذه العينة بشكل متسلسل للوحة موضعية (الخطوة 9) التي ستستخدمها لحساب كفاءة التحويل.

8. انثر باقي الخليط على لوحة وسائط انتقائية تفتقر إلى اليوراسيل. انقل تفاعل التحول إلى اللوحة ، ثم هز حوالي 4 حبات زجاجية معقمة من شأنها أن تنشر الخلايا. قم بتغطية الألواح وقضاء 0.5-1 دقيقة في تقليب الألواح بحيث تنشر الحبيبات خليط التحول بالتساوي على سطح اللوحة. تخلص من الخرز الزجاجي في حاويات النفايات المناسبة ، بحيث يمكن تعقيمها واستخدامها مرة أخرى. احتضان اللوحات عند 30 درجة مئوية حتى يمكن الكشف عن المستعمرات. أقرب وقت تظهر فيه المستعمرات عادة ما يكون يومين. إذا كانت المستعمرات صغيرة ، اسمح لها بالنمو يومًا (أيام) إضافية عند 30 درجة مئوية. عد عدد المستعمرات على اللوحة.

تحديد عدد الخلايا القابلة للحياة في خليط التحول.

9. قم بإعداد سلسلة من 4 تخفيفات إضافية للخلايا الموضوعة جانبًا في الخطوة 7. استخدم هذه التخفيفات
للحصول على لوحة موضعية على وسائط YPD. يجب أن يحتوي كل صف على اللوحة على خلايا من تفاعل تحويل مختلف. احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة حتى يمكن الكشف عن المستعمرات الفردية. لا تسمح للصفيحة بالنمو الزائد ، لأنك تحتاج إلى التمييز بين المستعمرات الفردية.

احسب كفاءة التحويل. تتأثر كفاءة التحول بكل من جودة الحمض النووي المستخدم والتفاصيل الدقيقة لإجراءات التحويل.

10. احسب جزء الخلايا التي تم تحويلها كما هو موضح أدناه. كان الحجم الإجمالي لخليط التحول حوالي 120 ميكرولتر ، بما في ذلك خلايا الخميرة. تم استخدام عشرة ميكرولتر للطلاء الموضعي واستخدمت 100 ميكرولتر المتبقية للتحول.

11. عادة ما يتم التعبير عن كفاءات التحول بعدد الخلايا المحولة لكل ميكروغرام من DNA. في المعمل الأخير (الفصل 11) ، قمت بتحليل مستحضرات البلازميد الخاصة بك على مواد هلامية agarose وحصلت على تقدير تقريبي لتركيزات DNA لمستحضرات البلازميد الخاصة بك. لاحظ أنك قمت بتحليل 7 ميكرولتر من إعداد البلازميد على تلك المواد الهلامية. في معمل التحويل هذا ، استخدمت 5 ميكرولتر من مستحضرات البلازميد.

احسب كفاءة التحويل:

أ. اضرب هذا العدد من الخلايا المحولة على لوحة YC في 1.1
(تم طلاء 100 فقط من 110 ميكرولتر في تفاعل التحويل.)

ب. تحويل نانوغرام البلازميد في رد فعل التحول الخاص بك إلى ميكروغرام.

ج. اقسم القيمة المحسوبة في A على تلك الموجودة في B.


تطوير أدوات البيولوجيا التركيبية للهندسة بيتشيا باستوريس كهيكل لإنتاج المنتجات الطبيعية

الخميرة الميثيلوتروفيكية بيتشيا باستوريس (الملقب ب. Komagataella phaffii) هو أحد أكثر العوائل استخدامًا للإنتاج الصناعي للبروتينات المؤتلفة. باعتبارها خميرة غير تقليدية ، P. باستوريس له خصائص بيولوجية فريدة وقد تم تطوير نظام التعبير الخاص به بشكل جيد. مع التقدم في البيولوجيا التركيبية ، تم تكريس المزيد من الجهود للتطوير P. باستوريس في هيكل لإنتاج العديد من المركبات عالية القيمة ، مثل المنتجات الطبيعية. تبدأ هذه المراجعة بإدخال أدوات البيولوجيا التركيبية لهندسة P. باستوريس، بما في ذلك النواقل ، والمروجين ، والمُنهي للتعبير الجيني غير المتجانسة بالإضافة إلى التكرارات المتناظرة القصيرة المنتظمة المتباعدة / النظام المرتبط بـ CRISPR (CRISPR / Cas) لتحرير الجينوم. ثم تتبع هذه المراجعة أمثلة على إنتاج المنتجات الطبيعية ذات القيمة المضافة في الهندسة الأيضية P. باستوريس سلالات. أخيرًا ، التحديات والتوقعات في التنمية P. باستوريس كهيكل بيولوجي تركيبي.


إعادة التركيب المرتبط بالتحول (TAR) الاستنساخ لدراسات الجينوم والبيولوجيا التركيبية

يمثل استنساخ إعادة التركيب المرتبط بالتحول (TAR) أداة فريدة لعزل جزيئات الحمض النووي الكبيرة ومعالجتها. تستغل هذه التقنية مستوى عالٍ من إعادة التركيب المتماثل في الخميرة Sacharomyces cerevisiae. حتى الآن ، يعد استنساخ TAR هو الطريقة الوحيدة المتاحة لاستعادة مقاطع كروموسومية بشكل انتقائي يصل طولها إلى 300 كيلو بايت من الجينومات المعقدة والبسيطة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح استنساخ TAR بتجميع واستنساخ جينومات ميكروبات كاملة تصل إلى عدة ميغا بايت بالإضافة إلى هندسة مسارات استقلابية كبيرة. في هذه المراجعة ، نلخص تطبيقات استنساخ TAR في الجينوميات الوظيفية / الهيكلية والبيولوجيا التركيبية.

الكلمات الدالة: HAC كروموسوم بشري اصطناعي بيولوجيا اصطناعية استنساخ TAR إعادة التركيب المرتبط بالتحول.

بيان تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح. لا تحتوي هذه المقالة على أي دراسات مع مشاركين بشريين أو حيوانات قام بها أي من المؤلفين.


تحول الخميرة

تم تقديم هذا البروتوكول من قبل مات كايبرلين.

يعمل هذا البروتوكول بشكل جيد لتحويل البلازميدات وأشرطة تعطيل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

  • TE + 100mM LiAc (مخفف المخزون 1M LiAc و 10x TE في الماء 1: 1: 8).
  • لوحة (1X TE ، 100 ملم LiAc 40٪ PEG)
  1. تنمو الخميرة لتتحول بين عشية وضحاها في YPD.
  2. قم بتخفيف الثقافة الليلية 1: 100 في YPD الطازج والثقافة عند 30 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعات.
  3. تدور لأسفل 15 مل من الخلايا.
  4. اغسل الخلايا 2X في 0.5 مل TE + 100 ملي LiAc
  5. Resuspend الخلايا في 200uL TE + LiAc
  6. أضف تحويل الحمض النووي.
  7. إضافة 20uL ssDNA المغلي الطازج.
  8. أضف 1 مل محلول صفيحة. مزيج عن طريق الانقلاب عدة مرات.
  9. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  10. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تخلط بالانعكاس كل 5 دقائق.
  11. تدور الخلايا واللوحة على وسائط انتقائية.

لتحويل الحمض النووي ، استخدم 1 ميكروليتر من الحمض النووي المصغر الإعدادية للبلازميد و 30-50 ميكرولتر من منتج PCR لاضطراب تفاعل البوليميراز المتسلسل.

من الناحية العملية ، عادةً ما أقوم بتوسيع نطاق 45 مل من الخلايا وتدويرها في أنبوب سعة 50 مل. أقوم بغسل 2X ثم قسمت الخلايا إلى 3 أنابيب إيبندورف فردية للتحول.


تحول النبات بوساطة الأجرعية: علم الأحياء والتطبيقات

يعتمد التحول الوراثي للنبات بشكل كبير على الممرض البكتيري Agrobacterium tumefaciens كأداة قوية لتوصيل الجينات ذات الأهمية إلى النبات المضيف. داخل نواة النبات ، يكون الحمض النووي المنقول قادرًا على الاندماج في جينوم النبات من أجل وراثة الجيل التالي (أي التحول المستقر). بدلاً من ذلك ، يمكن أن يظل الحمض النووي الغريب مؤقتًا في النواة دون الاندماج في الجينوم ولكن لا يزال يتم نسخه لإنتاج منتجات جينية مرغوبة (أي التحول العابر). من اكتشاف A. tumefaciens إلى تطبيقاتها الواسعة في التكنولوجيا الحيوية النباتية ، تم توضيح جوانب عديدة من التفاعل بين A. tumefaciens والنباتات. تهدف هذه المقالة إلى تقديم مراجعة شاملة لبيولوجيا وتطبيقات التحول النباتي بوساطة الأجرعية ، والتي قد تكون مفيدة لكل من علماء الأحياء الدقيقة وعلماء الأحياء النباتية الذين يرغبون في فهم أفضل لتحول النبات ، وتعبير البروتين في النباتات ، والتفاعل بين النبات والميكروبات. .

الأرقام

الخطوات الرئيسية للجرعية ...

الخطوات الرئيسية لعملية تحول النبات بوساطة الأجرعية. (1) مرفق أ ...


تحول الخميرة - كفاءة منخفضة (15 ديسمبر / 2008)

مرحبا بالجميع،
أقوم بتحويل الخميرة باستخدام طريقة LiOAc / PEG. كانت الكفاءة منخفضة ، حوالي 10 ^ 3-10 ^ 4 مستعمرات / ميكروغرام بلازميد.

كان البروتوكول:
240 ماي 50٪ وزن / حجم PEG3350
35 ماي 1 م LiOAc
25 ul الناقل ssDNA
1 ماي بلازميد
تخلط جيدا وتضاف إلى الخلايا المغسولة.
30 درجة مئوية ، 30 دقيقة
42 درجة مئوية ، 20 دقيقة
تدور لأسفل ، وتعلق في الماء
تصفيح

ما نوع الخميرة التي تعمل بها؟

إذا كان هذا هو S.pombe ، أود أن أقول أنه يجب عليك زيادة مدة حضانة 30 درجة مئوية إلى ساعة واحدة ، وتقليل الصدمة الحرارية (42 درجة مئوية) إلى حوالي 10-5 دقائق (أنا شخصياً أستخدم 5 دقائق) وإضافة 42ul DMSO لتحسين الصدمة الحرارية .

أيضا ما مدى صعوبة غزل الخلايا الخاصة بك؟ قم بالدوران لأقصر وقت ممكن وبأقل إعداد سرعة يمكن لجهازك أن يذهب إليه. تكون خلايا الخميرة هشة بعد بروتوكول التحول.

إذا قمت بإضافة DMSO ، فقم بغسله قبل طلاء الخلايا.

بمجرد طلاء الخلايا الخاصة بك ، حافظ على ترطيب الحاضنة. S.pombe لا يحب أسطح الألواح الجافة. هذا يساعد على تحسين معدل النمو ومعدل الشفاء إلى حد أقل. لذلك إذا كنت تستخدم الرطوبة وتقوم بإحصاء المستعمرات ، فتأكد من القيام بذلك لجميع تجاربك.

هل يمكن أن تخبرني المزيد عما تفعله بمجرد أن تصبح ثقافة الخلية جاهزة. هل تغسل خلاياك في TE + LiAc قبل صنع مزيج نهائي من الحمض النووي + الخلايا؟

أخيرًا ، يعتبر بروتوكول تحويل LiAc خامًا بعض الشيء ويمكن دفعه إلى حوالي 10 ^ 5 مستعمرات / ميكروغرام DNA ولكن ليس أكثر من ذلك بكثير. هناك بروتوكولات أفضل ، لكنها أكثر تعقيدًا وتستغرق وقتًا طويلاً.

شكرا لك ، perneseblue ،
أنا أعمل مع بيكر & # 39 s خميرة. تم تكوير الخلايا بواسطة cfg عند 3000 دورة في الدقيقة ، 5 دقائق. تغسل مرة واحدة بماء بحجم 1x. تمت إضافة مزيج التحويل (plamsid ، ssDNA ، PEG3350 ، LiOAc) إلى بيليه الخلية. مختلطًا بالدوامة لمدة 10 ثوانٍ. بعد 30 دقيقة 30 درجة مئوية ، و 20 دقيقة حضانة 42 درجة مئوية ، يتم تكوير الخلايا ، وتعليقها في الماء ، وتغليفها على ألواح اختيار.
سأحاول إضافة DMSO في المرة القادمة.


تحول الخميرة

يعتمد هذا البروتوكول على Gietz و R.D. و R.A. الغابة. (2002) تحويل الخميرة بواسطة Liac / SS CARRIER DNA / طريقة الربط. طرق في علم الإنزيمات 350: 87-96. تستند بعض خطوات هذا البروتوكول إلى المعلومات التي تم الحصول عليها من:

هذا البروتوكول معمم ولا يعتبر الأمثل لجميع السلالات والظروف والتطبيقات. قد يتعين تعديل بعض جوانب هذا البروتوكول بشكل كبير لتلائم احتياجاتك الخاصة. إنه يعمل من أجل التحول البسيط ، والاستهداف في الخميرة ، وإصلاح GAP ، والتحولات متعددة البلازميد لاثنين من الهجين.

1) خط الخميرة أو التصحيح على YAPD لمدة 24-48 ساعة. يمكن أيضًا استخدام الخميرة من الأطباق القديمة (3 أشهر؟ عند 4 درجات) إذا لم تكن الكفاءة مشكلة وتعاونت السلالة.

2) تلقيح ثقافات 2 × 3-5 مل في وسائط 2xYAPD أو SC (أنابيب الغطاء المفاجئ 15 مل) من الخط الجديد واحتضان O / N 30 درجة ، 200 دورة في الدقيقة. قد تحتاج وسائط SC إلى البذر بشكل أكبر (أو قد يلزم المزيد من الأنابيب).

يمكن استبدال YAPD بـ 2xYAPD ولكن الكفاءة ستنخفض بعضًا وستستغرق الخميرة وقتًا أطول لتنمو.

1) ما قبل التسخين 50 مل 2 × YAPD إلى 30 درجة في دورق سعة 500 مل (10 دقائق على الأقل). قم بتشغيل حمام مائي 42 درجة (يستغرق 30 دقيقة أو أكثر).

2) تمييع ثقافة O / N 1:10 في الماء وخذ OD عند 600 نانومتر. استخدم 2xYAPD (أو YAPD أو SC عند الاقتضاء) مخفف 1:10 في الماء كفراغ. عادة ما يكون للثقافة المخففة OD يتراوح بين 0.1 و 1.0.

3) تمييع الثقافة إلى ما يقرب من 0.1 OD في 50 مل 2xYAPD قبل التسخين واحتضان 3-6 ساعات حتى يصل OD إلى 1.0 (أو قريب). تختلف معدلات نمو الخميرة ، لذا كن مستعدًا للانتظار. عادة ما يستغرق الأمر من 5 إلى 6 ساعات ولكن قد يستغرق وقتًا أطول قليلاً.

مثال: الثقافة المخففة في الخطوة 2 لها OD أو 0.2 لذا فإن الثقافة OD هي 2.0. للحصول على OD يبلغ 0.1 تقريبًا للخطوة 3 ، يمكنك إضافة 2.5 مل من الثقافة إلى 50 مل 2 × YAPD المُسخَّن مسبقًا (تخفيف 20 مرة). من الواضح أن الأمر ليس دقيقًا لأنه سيكون لديك الآن 52.5 مل بدلاً من 50 مل ولكنه قريب بما يكفي. إذا كنت تريد ذلك بالضبط ، يمكنك ببساطة إزالة 2.5 مل 2 × YAPD من القارورة قبل إضافة ثقافتك 2.5 مل ولكن هذا ليس ضروريًا.

4) بيليه 3000 دورة في الدقيقة ، 10 دقيقة عند RT في RT6000 أو أجهزة طرد مركزي مماثلة.

5) أثناء غزل الخميرة ، اغلي سمك السلمون المنوي DNA لمدة 5 دقائق مع غطاء الغليان وقم بتبريده على الثلج. استخدم 3-4 مرات (التخزين عند -20) واحصل على أنبوب جديد. لا تغلي مرة بعد مرة.

6) إعادة التعليق في 1 مل ddH2O ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل.

7) دوامة 1 دقيقة أو حتى الخميرة في حالة تعليق (بدون كتل).

8) بيليه بسرعة قصوى ، 30 ثانية ، RT وإعادة التعليق في 1 مل ddH2O عن طريق دوامة كما كان من قبل. سيتم استخدام 100ul لكل عملية تحويل بحيث يكون هناك ما يكفي من الخميرة لإجراء 10 تحويلات.

9) انقل 100 مايكرولتر من الخميرة إلى أنبوب منفصل سعة 1.5 مل لكل عملية تحويل وكرية بأقصى سرعة ، 30 ثانية ، RT وإزالة المادة الطافية.

10) لكل تحويل يشكل ما يلي (مزيج رئيسي أو منفصل):

50ul من 2mg / ml السلمون الحيوانات المنوية DNA

34ul أو البلازميد الخاص بك + الماء (1ul من DNA miniprep البكتيري كثير)

11) أضف مزيج (خلطات) التحويل إلى كريات الخميرة من الخطوة رقم 9 ودوامة دقيقة واحدة أو حتى تكون الخميرة في حالة تعليق (بدون تكتلات).

12) ضع الخميرة عند 42 درجة لمدة 40 دقيقة. للحصول على أفضل كفاءة ، يجب تحديد وقت الصدمة الأمثل تجريبياً ويمكن أن يتراوح من 10 دقائق إلى 60 دقيقة. من أجل اختيار واحد بسيط ، عادةً ما يعمل تحويل البلازميد 20-30 دقيقة بشكل جيد.

13) بيليه بسرعة قصوى ، 30 ثانية ، RT وإزالة مزيج التحويل.

14) أضف 1 مل ddH2O واستخدم طرف ماصة 1 مل لتحريك الخلايا في المحلول. إذا لزم الأمر ، قم بتقطيع الخميرة لأعلى ولأسفل برفق شديد.

15) لوحة 200ul على ألواح انتقائية مناسبة مقاس 100 مم أو 150 مم وتنمو 3-4 أيام عند 30 درجة. * بدلاً من 1 مل في الخطوة 14 ، يمكنك أيضًا إعادة تعليق الخميرة في 400ul وطبق الكمية بالكامل على لوحة واحدة بحجم 150 مم إذا كنت ترغب في ذلك.

تختلف الكفاءة اعتمادًا كبيرًا على الإجهاد وتحويل الحمض النووي. يمكن أن تختلف من 1 & # 21510 ^ 3 إلى 1 & # 21510 ^ 5 (أو نحو ذلك) مستعمرات لكل ميكروغرام من DNA المدخلات (لبلازميد DNA).

10 جرام من مستخلص خميرة BactoYeast

100mg هيميسلفات الأدينين

الأوتوكلاف 20 دقيقة في دورة السائل.

يختلف الوسيط الانتقائي بناءً على الإجهاد والتطبيق.

2 ملغ / مل في TE. سيجما D1626. اصنع 100 مل في دورق باستخدام محرض مغناطيسي. يستغرق 2-4 ساعات ليذوب. قسامة في أنابيب 1.5 مل (1 مل / أنبوب).

ضع 50 جم من البولي إيثيلين جلايكول ، MW 3350 (Sigma) في دورق زجاجي سعة 150 مل وأضف 35 مل من ddH20. يقلب لمدة 1-2 ساعة بقضيب تحريك مغناطيسي حتى يذوب. ف. إلى 100 مل واستمر في التقليب لمدة 10 دقائق على الأقل للخلط. التصفية باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر وقسامة في مخروطي 15 مل (10 مل لكل منهما) وتخزينها في RT.

1.0M خلات الليثيوم. لا حاجة لدرجة الحموضة.

تيم شيدل ، دكتوراه
قسم علم الوراثة
صندوق الحرم الجامعي # 8232
كلية الطب بجامعة واشنطن
4566 سكوت افي.
سانت لويس ، مو 63110


شاهد الفيديو: تبادل الإشارة في تكاثر الخميرة. الأحياء. التواصل بين الخلايا (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Neese

    موضوع لا نهائي

  2. Ghoukas

    أعتقد أنه تمت مناقشته بالفعل.

  3. Ulmar

    نعم حقا.

  4. Sedgeley

    عدد قليل من المشاعر .. لكن جميلة ...

  5. Addaneye

    رائع ، هذه الجملة الثمينة



اكتب رسالة