معلومة

2.3: جدار الخلية الببتيدوغليكان - علم الأحياء

2.3: جدار الخلية الببتيدوغليكان - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أهداف التعلم

  1. اذكر الأجزاء الثلاثة لمونومر ببتيدوغليكان وحدد وظيفة الببتيدوغليكان في البكتيريا.
  2. صف بإيجاز كيف تقوم البكتيريا بتوليف الببتيدوغليكان ، مشيرًا إلى أدوار autolysins ، والبكتوبرينول ، و transglycosylase ، و transpeptidases.
  3. صف بإيجاز كيف تؤثر المضادات الحيوية مثل البنسلين والسيفالوسبورين والفانكومايسين على البكتيريا وربط ذلك بتركيب جدار الخلية.
  4. اذكر لون البكتيريا موجبة الجرام وصمة عار بعد تلطيخ الجرام.
  5. اذكر لون البكتيريا سالبة الجرام وصمة عار بعد تلطيخ الجرام.
  6. اذكر لون البكتيريا المقاومة للأحماض التي تلطخ بعد تلطيخ الحمض.

الميكوبلازما هي البكتيريا الوحيدة التي تفتقر بشكل طبيعي إلى جدار خلوي. تحافظ الميكوبلازما على ضغط متساوٍ تقريبًا بين البيئة الخارجية والسيتوبلازم عن طريق ضخ أيونات الصوديوم بنشاط. تحتوي أغشيتها السيتوبلازمية أيضًا على الستيرولات التي توفر على الأرجح قوة إضافية. البكتيريا المتبقية في المجال بكتيريا، باستثناء عدد قليل من البكتيريا مثل الكلاميديا ​​، لها جدار خلوي شبه صلب يحتوي على الببتيدوغليكان. (بينما تنتمي البكتيريا إلى المجال العتيقة يحتوي أيضًا على جدار خلوي شبه صلب ، ويتكون من مواد كيميائية متميزة عن الببتيدوغليكان مثل البروتين أو السودومورين. لن نتناول العتيقة هنا.)

وظيفة الببتيدوجليكان

يمنع الببتيدوجليكان التحلل التناضحي. كما رأينا سابقًا تحت الغشاء السيتوبلازمي ، تركز البكتيريا المغذيات الذائبة (المذابة) من خلال النقل النشط. نتيجة لذلك ، عادة ما يكون سيتوبلازم البكتيريا مفرط التوتر في البيئة المحيطة بها ويكون التدفق الصافي للمياه الحرة في البكتيريا. بدون جدار خلوي قوي ، ستنفجر البكتيريا من الضغط الأسموزي للمياه المتدفقة إلى الخلية.

هيكل وتكوين الببتيدوجليكان

مع الاستثناءات المذكورة أعلاه ، أعضاء المجال بكتيريا لها جدار خلوي يحتوي على مركب جزيئي شبه صلب ومحكم يسمى ببتيدوغليكان. الببتيدوغليكان ، المعروف أيضًا باسم مورين ، هو بوليمر ضخم يتكون من سلاسل متشابكة من مونومرات ببتيدوغليكان متطابقة (الشكل ( PageIndex {1} )). يتكون مونومر الببتيدوغليكان من سكرين أمينيين متصلين ، N-acetylglucosamine (NAG) و N-acetylmuramic acid (NAM) ، مع خروج خماسي الببتيد من NAM (الشكل ( PageIndex {2} )). أنواع وترتيب الأحماض الأمينية في خماسي الببتيد ، في حين أنها متطابقة تقريبًا في البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام ، تظهر بعض الاختلاف الطفيف بين المجال بكتيريا.

يتم تصنيع مونومرات الببتيدوغليكان في العصارة الخلوية للبكتيريا حيث ترتبط بجزيء حامل غشاء يسمى بكتوبرينول. كما نوقش أدناه ، تنقل البكتوبرينول مونومرات الببتيدوغليكان عبر الغشاء السيتوبلازمي وتعمل مع الإنزيمات التي تمت مناقشتها أدناه لإدخال المونومرات في الببتيدوغليكان الموجود مما يتيح نمو البكتيريا بعد الانشطار الثنائي.

بمجرد إدخال مونومرات الببتيدوغليكان الجديدة ، تقوم الروابط الجليكوسيدية بعد ذلك بربط هذه المونومرات في سلاسل النمو من الببتيدوغليكان. ثم يتم ربط سلاسل السكر الطويلة هذه ببعضها البعض عن طريق الروابط المتقاطعة الببتيدية بين الببتيدات الآتية من NAMs. من خلال ربط صفوف وطبقات السكريات معًا بهذه الطريقة ، توفر الروابط المتقاطعة الببتيدية قوة هائلة لجدار الخلية ، مما يجعلها تعمل بشكل مشابه لسور رابط السلسلة الجزيئية حول البكتيريا (انظر الشكل ( فهرس الصفحة {1}) )).

تخليق ببتيدوجليكان

من أجل زيادة حجم البكتيريا بعد الانشطار الثنائي ، يجب كسر الروابط في الببتيدوغليكان ، ويجب إدخال مونومرات ببتيدوغليكان جديدة ، ويجب إعادة إغلاق الروابط المتقاطعة الببتيدية. التسلسل التالي للأحداث يحدث:

الخطوة 1. إنزيمات بكتيرية تسمى autolysins:

الخطوة 2. يتم تصنيع مونومرات الببتيدوغليكان في العصارة الخلوية (انظر الشكل ( PageIndex {4} ) ، الخطوة 1 والشكل ( PageIndex {4} ) ، الخطوة -2) وربطها بالبكتوبرينول. تنقل البكتوبرينول المونومرات الببتيدوغليكان عبر الغشاء السيتوبلازمي وتتفاعل مع ترانسجليكوزيدات لإدخال المونومرات في الببتيدوغليكان الموجود (انظر الشكل ( PageIndex {4} ) ، الخطوة 3 ، الشكل ( PageIndex {4} ) ، الخطوة -4 ، الشكل ( PageIndex {4} ) ، والخطوة 5 ، والشكل ( PageIndex {4} ) ، الخطوة -6)

الخطوة 3. تقوم إنزيمات Transglycosylase (transglycosidase) بإدراج وربط مونومرات الببتيدوغليكان الجديدة في الفواصل الموجودة في الببتيدوغليكان (انظر الشكل ( PageIndex {5} ) ، الخطوة 1 والشكل ( PageIndex {5} ) ، الخطوة 2) .

الخطوة 4. أخيرًا ، تعمل إنزيمات transpeptidase على إصلاح الروابط المتقاطعة الببتيدية بين صفوف وطبقات الببتيدوجليكان لجعل الجدار قويًا (انظر الشكل ( PageIndex {6} ) ، الخطوة 1 وانظر الشكل ( PageIndex {6} )، الخطوة 2).

في الإشريكية القولونية، يتم شق D- ألانين من خماسي الببتيدات لتشكيل رباعي الببتيدات. يوفر هذا الطاقة لربط D- ألانين لرباعي ببتيد واحد بحمض ديامينوبيمليك لرباعي ببتيد آخر (انظر الشكل ( PageIndex {1} ) ب). في حالة المكورات العنقودية الذهبية، يتم شق D- ألانين من خماسي الببتيدات لتشكيل رباعي الببتيدات. يوفر هذا الطاقة لربط جسر البنتاغليسين (5 جزيئات من حمض الجلايسين الأميني) من D- ألانين لرباعي ببتيد واحد إلى L-lysine في الآخر (انظر الشكل ( PageIndex {1} ) أ).

تمرين: أسئلة فكر - ثنائي - شارك

  1. كما سنرى في الوحدة 2 ، فإن المضاد الحيوي bacitracin يرتبط بالبكتوبرينول بعد أن يدخل مونومر ببتيدوغليكان في جدار الخلية البكتيرية النامية.

    اشرح كيف يمكن أن يؤدي ذلك إلى موت تلك البكتيريا.

  2. كما سنرى في الوحدة 2 ، فإن المضادات الحيوية للبنسلين ترتبط بالإنزيم البكتيري transpeptidase.
    1. اشرح كيف يمكن أن يؤدي ذلك إلى موت تلك البكتيريا.
    2. هل يمكن استخدام هذا المضاد الحيوي لعلاج عدوى البروتوزوا مثل الجيارديا وداء المقوسات؟

في وسط البكتيريا ، تتفاعل مجموعة من البروتينات تسمى Fts (حساسة لدرجة الحرارة الخيطية) لتشكل حلقة في مستوى انقسام الخلية. تشكل هذه البروتينات جهاز الانقسام الخلوي المعروف باسم القسمة وتشارك بشكل مباشر في انقسام الخلايا البكتيرية عن طريق الانشطار الثنائي (انظر الشكل ( PageIndex {1} ) والشكل ( PageIndex {2} )).

القسم هو المسؤول عن توجيه تخليق الغشاء السيتوبلازمي الجديد والببتيدوجليكان الجديد لتشكيل الحاجز الانقسام.

العوامل المضادة للميكروبات التي تمنع تخليق الببتيدوغليكان مسببة التحلل البكتيري

تعمل العديد من المضادات الحيوية عن طريق تثبيط التوليف الطبيعي للببتيدوجليكان في البكتيريا مما يؤدي إلى انفجارها نتيجة التحلل التناضحي. كما ذكرنا للتو ، من أجل زيادة حجم البكتيريا بعد الانشطار الثنائي ، تقوم الإنزيمات المسماة autolysins بتفكيك الروابط الببتيدية المتقاطعة في إنزيمات الببتيدوغليكان ، وإنزيمات Transglycosylase ثم إدخال وربط مونومرات الببتيدوغليكان الجديدة في الفواصل في الببتيدوغليكان ، وتقوم إنزيمات transpeptidase بإصلاح الببتيد روابط متقاطعة بين صفوف وطبقات الببتيدوجليكان لجعل الجدار قويًا.

يؤدي التداخل مع هذه العملية إلى ضعف جدار الخلية وتحلل البكتيريا من الضغط الاسموزي. تشمل الأمثلة البنسلينات (البنسلين جي ، الميثيسيلين ، الأوكساسيلين ، الأمبيسيلين ، الأموكسيسيلين ، التيكارسيلين ، إلخ) ، السيفالوسبورينات (سيفالوثين ، سيفازولين ، سيفوكسيتين ، سيفوتاكسيم ، سيفاكلور ، سيفوبيرازون ، سيفيكسيمزيم ، سيفالوسيبرين) imipenem ، metropenem) ، و monobactems (aztreonem) ، و carbacephems (loracarbef) ، و glycopeptides (vancomycin ، teichoplanin).

  • على سبيل المثال ، يرتبط البنسلين والسيفالوسبورين بإنزيمات الترانسببتيداز (وتسمى أيضًا بروتينات ربط البنسلين) المسؤولة عن سد جدار الخلية حيث يتم إضافة مونومرات ببتيدوغليكان جديدة أثناء نمو الخلايا البكتيرية. هذا يمنع إنزيمات الترانسببتيداز من الارتباط المتقاطع لسلاسل السكر وينتج عنه جدار خلوي ضعيف وتحلل تناضحي لاحق للبكتيريا (انظر الشكل ( PageIndex {8} )).

عرض الرسوم المتحركة الفلاش كيف يمنع البنسلين تخليق الببتيدوغليكان.
© جولييت في سبنسر ، ستيفاني ك.م. Wong ، المؤلفون ، المرخص لهم للاستخدام ، ASM MicrobeLibrary.

ستتم مناقشة العلاج الكيميائي بمضادات الميكروبات بمزيد من التفصيل لاحقًا في الوحدة 2 تحت السيطرة على البكتيريا باستخدام المضادات الحيوية والمطهرات.

البكتيريا موجبة الجرام ، سلبية الجرام ، والحمضية السريعة

يمكن وضع معظم البكتيريا في واحدة من ثلاث مجموعات بناءً على لونها بعد إجراء إجراءات تلطيخ محددة: موجبة الجرام ، أو سلبية الجرام ، أو سريعة الحمضية.

  • البكتيريا موجبة الجرام: هذه تحافظ على صبغة الكريستال البنفسجي الأولية أثناء إجراء صبغة جرام وتظهر بنفسجية عند ملاحظتها من خلال المجهر. تشمل البكتيريا الشائعة إيجابية الجرام ذات الأهمية الطبية العقدية المقيحة ، العقدية الرئوية ، المكورات العنقودية الذهبية ، المكورات المعوية البرازية ، و المطثية محيط.

(يسار) صبغة جرام من Staphylococcus aureus وهي عبارة عن مكورات موجبة الجرام (أرجوانية) في مجموعات. (يمين) صبغة جرام من الإشريكية القولونية عصيات سالبة الجرام (وردية).

  • البكتيريا سالبة الجرام: تزيل هذه الألوان أثناء إجراء صبغة الجرام ، وتلتقط الصبغة المضادة للصفرانين ، وتظهر باللون الوردي عند ملاحظتها من خلال المجهر. تشمل البكتيريا سالبة الجرام الشائعة ذات الأهمية الطبية السالمونيلا محيط، شيغيلا محيط، النيسرية البنية ، النيسرية السحائية ، المستدمية النزلية ، الإشريكية القولونية ، الكلبسيلة الرئوية ، المتقلبة الأنواع و الزائفة الزنجارية. انظر أيضًا إلى صبغة جرام لمزيج من البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام.

صبغة جرام من خليط من البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام. لاحظ عصيات سالبة الجرام (وردية) وكوتشي موجبة الجرام (أرجوانية).

  • البكتيريا المقاومة للأحماض: هذه تقاوم إزالة اللون بمزيج حمض كحول أثناء إجراء وصمة عار الحمضية ، وتحتفظ بالصبغة الأولية carbolfuchsin وتظهر باللون الأحمر عند ملاحظتها من خلال المجهر. تشمل البكتيريا الشائعة المقاومة للأحماض ذات الأهمية الطبية المتفطرة السلية ، المتفطرة الجذامية ، و المتفطرة الطيرية داخل الخلوية مركب.

بقعة حامضية سريعة من المتفطرة السلية في البلغم. لاحظ العصيات الحمضية السريعة الحمضية بين النباتات الطبيعية الزرقاء وخلايا الدم البيضاء في البلغم التي لا تصوم الحمض.

ترجع تفاعلات التلوين هذه إلى الاختلافات الأساسية في جدارها الخلوي كما سيتم مناقشته في المختبر 6 والمختبر 16. سننظر الآن في كل نوع من أنواع جدار الخلية البكتيرية الثلاثة.

القاتل

1. الهيكل والتكوين

جدار الخلية الأكثر شيوعًا في أنواع العتيقة هي طبقة سطحية بلورية (طبقة S). يتكون من طبقة منظمة بشكل منتظم تتكون من بروتين سكري متشابك أو جزيئات بروتينية. في الصور المجهرية الإلكترونية ، لها نمط يشبه بلاط الأرضيات. على الرغم من اختلافها باختلاف الأنواع ، فإن طبقات S عمومًا لها سمك يتراوح بين 5 و 25 نانومتر ولها مسام متطابقة بقطر 2-8 نانومتر. عدة أنواع من بكتيريا تم العثور أيضًا على طبقات S.

لعرض الصور المجهرية الإلكترونية لطبقات S ، انظر ما يلي:

  • بروتينات الطبقة S ، الصفحة الرئيسية للبيولوجيا الهيكلية في جامعة كارل فرانزينس في النمسا.
  • الخصائص المميزة لبروتينات الطبقة S ، في معهد Foresight Nanotech في النمسا.

2. وظائف وأهمية البكتيريا المسببة للعدوى

ارتبطت الطبقة S بعدد من الوظائف الممكنة. وتشمل هذه ما يلي:

أ. قد تحمي الطبقة S البكتيريا من الإنزيمات الضارة ، من التغيرات في درجة الحموضة ، من البكتيريا المفترسة بيديلوفيبريو، وهي بكتيريا طفيلية تستخدم حركتها بالفعل لاختراق البكتيريا الأخرى والتكاثر داخل السيتوبلازم الخاص بها ، ومن العاثيات.

ب. يمكن أن تعمل الطبقة S كالتصاق ، مما يمكّن البكتيريا من الالتصاق بالخلايا المضيفة والأسطح البيئية ، والاستعمار ، ومقاومة التنظيف.

ج. قد تساهم الطبقة S في الفوعة من خلال حماية البكتيريا من الهجوم التكميلي والبلعمة.

د. قد تعمل الطبقة S كمنخل جزيئي خشن.

ملخص

  1. الغالبية العظمى من البكتيريا لها جدار خلوي صلب يتكون من الببتيدوغليكان.
  2. يحيط جدار الخلية الببتيدوغليكان بالغشاء السيتوبلازمي ويمنع التحلل التناضحي.
  3. يتكون الببتيدوغليكان من سلاسل متشابكة من لبنات البناء تسمى مونومرات ببتيدوغليكان.
  4. من أجل النمو بعد الانشطار الثنائي ، يتعين على البكتيريا تصنيع مونومرات ببتيدوغليكان جديدة في السيتوبلازم ، ونقل تلك المونومرات عبر الغشاء السيتوبلازمي ، ووضع فواصل في جدار الخلية الموجود بحيث يمكن إدخال المونومرات ، وربط المونومرات بالببتيدوغليكان الموجود ، و عبر ربط صفوف وطبقات الببتيدوغليكان.
  5. العديد من المضادات الحيوية تمنع تخليق الببتيدوغليكان في البكتيريا وتؤدي إلى التحلل التناضحي للبكتيريا.
  6. يمكن وضع معظم البكتيريا في واحدة من ثلاث مجموعات بناءً على لونها بعد إجراء إجراءات تلطيخ محددة: موجبة الجرام ، أو سلبية الجرام ، أو سريعة الحمضية. ترجع تفاعلات التلوين هذه إلى الاختلافات الأساسية في جدار الخلية البكتيرية.
  7. تلطخ البكتيريا موجبة الجرام اللون الأرجواني بعد تلطيخ الجرام بينما تلطخ البكتيريا سالبة الجرام اللون الوردي.
  8. تلطخ البكتيريا المقاومة للأحماض باللون الأحمر بعد تلطيخها سريع الحموضة.

أسئلة

ادرس المادة في هذا القسم ثم اكتب الإجابات على هذه الأسئلة. لا تضغط فقط على الإجابات وتكتبها. هذا لن يختبر فهمك لهذا البرنامج التعليمي.

  1. يتكون مونومر الببتيدوغليكان من _____________ و _____________ و _______________. (الجواب)
  2. اذكر وظيفة الببتيدوغليكان في البكتيريا. (الجواب)
  3. اذكر دور الإنزيمات التالية في تخليق الببتيدوغليكان:
    1. autolysins (الجواب)
    2. بكتوبرينول (الجواب)
    3. transpeptidases (الجواب)
    4. ترانسجليكوزيلاز (الجواب)
  4. يستخدم البنسلين لعلاج عدوى بكتيرية. صف الآلية التي يقتل بها هذا المضاد الحيوي البكتيريا في النهاية. (الجواب)
  5. بقعة البكتيريا موجبة الجرام ____________ (الجواب) بعد تلطيخ الجرام بينما تلطخ البكتيريا سالبة الجرام _____________ (الجواب).
  6. تعيش البكتيريا عادة في بيئة منخفضة التوتر. بما أن الماء يتدفق إلى خلية في بيئة منخفضة التوتر ، فلماذا لا تنفجر البكتيريا من الضغط الاسموزي؟ (الجواب)
  7. متعدد الخيارات (الجواب)


استخدام الفحص المعتمد على التألق لقياس التغيرات المحتملة في غشاء الإشريكية القولونية في الإنتاجية العالية

يصعب قياس إمكانات الغشاء البكتيري باستخدام تقنيات الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية نظرًا لصغر حجم الخلية ووجود جدار الخلية الببتيدوغليكان. بدلاً من ذلك ، غالبًا ما تُستخدم المجسات الكيميائية لدراسة التغيرات المحتملة في الغشاء في ظل ظروف الاهتمام. العديد من هذه المجسات عبارة عن جزيئات فلورية تتراكم بطريقة تعتمد على الشحن ، ويمكن تحليل التغيير الناتج عن التألق عن طريق قياس التدفق الخلوي أو باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية. على الرغم من أن هذه التقنية تعمل بشكل جيد في العديد من البكتيريا موجبة الجرام ، إلا أنها تولد نسب إشارة إلى ضوضاء منخفضة إلى حد ما في البكتيريا سالبة الجرام بسبب استبعاد الصبغة بواسطة الغشاء الخارجي. نحن بالتفصيل سير العمل الأمثل الذي يستخدم مسبار الغشاء المحتمل ، 3،3'-diethyloxacarbocyanine iodide [DiOC2(3)] ​​، للقياس الإشريكية القولونية التغييرات المحتملة للغشاء في الإنتاجية العالية ووصف ظروف الفحص التي تولد نسب إشارة إلى ضوضاء كبيرة لاكتشاف التغيرات المحتملة في الغشاء باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية. يوضح منحنى معايرة فالينومايسين أن هذا النهج يمكنه الإبلاغ بقوة عن إمكانات الغشاء على نطاق ∼144-mV على الأقل بدقة ∼12 mV. كدليل على المفهوم ، استخدمنا هذا النهج لوصف تأثيرات بعض الجزيئات الصغيرة المتاحة تجاريًا والمعروفة بإحداث تغييرات محتملة في الغشاء في الأنظمة الأخرى ، مما يزيد من مخزون المركبات المعروفة بأنها مضطربة. بكتريا قولونية طاقة الغشاء. تم العثور على مركب واحد ، حقيقي النواة Ca 2+ مانع قناة أملوديبين ، للتغيير بكتريا قولونية إمكانات الغشاء وتقليل MIC للكاناميسين ، مما يدعم قيمة نهج الفحص هذا. هذه المنهجية التفصيلية تسمح بالدراسة بكتريا قولونية تتغير إمكانات الغشاء بسرعة وبشكل موثوق على مستوى السكان.

الكلمات الدالة: CCCP DiOC2 (3) E. coli سالبة الجرام أملوديبين أنتيمايسين كلوريد الباريوم غشاء عالي الإنتاجية فالينوميسين محتمل.

حقوق النشر © 2020 الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة.

الأرقام

تأثير EDTA على DiOC 2 (3) الإشريكية القولونية المحملة. (أ) أطياف التألق ...

آثار EDTA و valinomycin ...

تأثيرات EDTA و valinomycin على الإشريكية القولونية. أعداد الخلايا القابلة للتطبيق من E. ...

استجابة الإشريكية القولونية لفالينوميسين بتركيزات مختلفة من بوكل. شدة الإسفار من ...

ديوك 2 (3) زادت مظاهر الإشريكية القولونية المحملة في إزالة الاستقطاب استجابةً لزيادة CCCP ...

آثار أملوديبين ، أنتيميسين ، الباريوم ...

تأثيرات أملوديبين ، وأنتيميسين ، وكلوريد الباريوم ، وأزيد الصوديوم على غشاء الإشريكية القولونية ...


نتائج

توليف مشتقات NAM واستخدامها بواسطة إنزيمات PG

اللبنات الأساسية لجدار الخلية البكتيرية هي glycans NAG و NAM. يستخدم هذا الأخير حصريًا باعتباره لبنة بناء PG (الشكل 1 ب). يتم إدخال السكاريد الأحادي NAM خلال الخطوة الأولى الملتزمة بالتخليق الحيوي لجدار الخلية البكتيرية مع تكوين UDP-ن- حمض الأسيتيل موراميك (UDP-MurNAc) (الشكل 1 ب). تم تثبيت المقبض المتعامد حيويًا في هذا الوسط. للتحايل على توليف الكميات بالجرام من مشتقات UDP-MurNAc واستراتيجيات التسليم المعقدة لشق ثنائي الفوسفات ، استخدمنا آلات إعادة تدوير جدار الخلية ، وهي غائبة في الإشريكية القولونية، ولكنها موجودة في العديد من الأنواع البكتيرية بما في ذلك Pseudomonas putida 41. إنزيم إعادة التدوير الشاذ NAM / NAG kinase (AmgK) يحول NAM 1 في MurNAc 1-فوسفات 1 أ، والذي يتم تحويله بعد ذلك إلى UDP-MurNAc 1 ب بواسطة MurNAc α-1-phosphate uridylyl transferase (MurU) (الشكل 1 ب ، ج). مفتونًا بوظيفة هذين الإنزيمين ، تم تنفيذ إستراتيجية تركيبية معيارية (الشكل 2 والطرق التكميلية) لبناء مشتقات NAM 2 و 3 (الشكل 1 ج).

تم تثبيت أزيد على الجلوكوزامين حمض الهيدروكلوريك باستخدام ديازوترانسفير متبوعًا بالأسيتيل للإنتاج 4. متوسط 4 تمت حمايته وتعديله عبر 5 خطوات: (1) أسيتات الهيدرازين (2) COCl2 متبوعًا بـ AgCO3، AgOTf و BnOH (iii) 0.5 M NaOMe (iv) PhCH (OMe)2، pTSA (v) 60٪ NaH ، (س)-2-حمض الكلوروبروبيونيك) لإنتاج 9. تم إنتاج إزالة الحماية العالمية عن طريق هدرجة Pd / C 10. تليها شروط اقتران NHS ، 2 و 3 يتم تصنيعها في 18.5٪ من العائد الإجمالي من الجلوكوزامين حمض الهيدروكلوريك المتاح تجارياً.

لتجميع الكميات اللازمة من مشتقات NAM ، قمنا بتحسين التوليف الذي تم الإبلاغ عنه مؤخرًا في مختبرنا لـ 2-azido MDP 40 (الشكل 2 والطرق التكميلية). أولاً ، قمنا بتعديل الشروط 42 لإنتاج كميات كبيرة من الجرام من 2-azido الوسيط 4 من حمض الهيدروكلوريك الجلوكوزامين المتاح تجاريًا (الشكل 2 والطرق التكميلية). باستخدام طريقتنا الثابتة لتركيب جزء حامض اللبنيك ، الوسيط 9 كان مستعدا. كشف الحرمان العالمي عن أزيد للكشف عن الأمين الثانوي في 2-ن موقع نواة NAM بكميات الجرام. يمكن تخزين المواد في هذا الوسيط. حمض الكربوكسيل الطرفي 9 تستعد لرابطة الهيدروجين مع الأمين الحر في الموضع 2 (الشكل 2 ، المركب 10) ، مما يجعل اقتران في 2-ن موقف التحدي. تم تطوير شروط الاقتران لتجميع مشتقات NAM بنجاح 2 و 3. تم تمييز هذه المركبات (الأشكال التكميلية 21 و 23 و 25 و 26) بعائد إجمالي 18.5 ٪ من الجلوكوزامين حمض الهيدروكلوريك.

مع وجود مشتقات NAM في متناول اليد ، قمنا بتقييم خصوصية الركيزة لأنزيمات إعادة التدوير ، AmgK و MurU 41. وجدنا أن هذه الإنزيمات كانت قادرة على التحويل 2 و 3 مع تعديلات متعامدة بيولوجيًا مثل أزيد أو ألكين في 2-ن-وضع الأسيتيل ، لإنتاج منتجات كربوهيدرات UDP ذات الصلة 2 ب و 3 ب، كما أكده الكروماتوجرافيا السائلة عالية الدقة وقياس الطيف الكتلي (HRLC / MS) (الجدول التكميلي 1). سمحت القدرة على تصنيع مشتقات NAM غير الطبيعية هذه بإثبات أن إنزيمات إعادة التدوير مختلطة. من الوسطاء 2 ب و 3 ب، تمكنا أيضًا من إثبات أن الإنزيمات التخليقية الحيوية (MurC-MurF ، الشكل 1 ب) قد خففت من خصوصية الركيزة كما أكدها HRLC / MS (الجدول التكميلي 1). إذا لم تتسامح هذه الإنزيمات مع التعديلات غير الطبيعية ، فلن تكون القدرة على تعديل كربوهيدرات NAM ممكنة. حفزتنا هذه البيانات على التحقق مما إذا كان الدمج الأيضي لـ NAM في PG للخلايا البكتيرية الكاملة يمكن تحقيقه.

تنقذ مجسات NAM البكتيريا من الجرعة المميتة من fosfomycin

مع العلم أن مسارات إعادة التدوير والمرحلة الأولى للتخليق الحيوي مختلطة ، تم تنفيذ اختبار قائم على الخلية لتسمية بوليمر PG حصريًا (الشكل 3 أ). أولاً ، من المعروف أنه في بكتريا قولونية استقلاب PG ، يمكن استيراد سكريات NAM عن طريق نظام نقل الفوسفوتروس (MurP) والمحصول ن43- حمض الأسيتيل الموراميك -6-فوسفات (الشكل 1 ب). يمكن لـ MurQ 44 ، المعروف باسم NAM-P etherase الوحيد ، أن يشق مكون حمض اللاكتيك D في ن-اسيتيل موراميكاسيد -6-فوسفات لإنتاج فوسفات NAG-6 (الشكل 1 ب). سيتم تقسيم مصير فوسفات NAG-6 إلى جزأين: (1) الدمج في بكتيرية جديدة PG ، و (2) التحلل والاستخدام كمصدر للكربون والطاقة 44. لتجنب التضمين الأيضي المحتمل لتحقيقات NAM من خلال مسارات تقويضية بديلة ، يتم إجراء بكتريا قولونية (MurQ) تم استخدام سلالة خروج المغلوب (بكتريا قولونية MurQ) 41. كما amgK و murU من P. putida، ليس من مواطنيها بكتريا قولونية، تم تقديم ناقل التعبير (pBBR-KU) لإنشاء ملف بكتريا قولونية سلالات ΔMurQ ، والتي يمكن أن تعبر عن إنزيمات AmgK و MurU بكتريا قولونية ΔMurQ-KU (طرق).

(أ) الإستراتيجية الشاملة لإعادة عرض PG. للبقاء على قيد الحياة في تثبيط fosfomycin ، تستخدم الخلايا الاختلاط في إعادة التدوير والإنزيمات التخليقية الحيوية لدمج كتل بناء NAM المتعامدة في PG. انقر فوق الكيمياء يتيح تعديل مضان على العمود الفقري لحركة عدم الانحياز للبكتيريا PG. (ب) DIC وصور فردية ثنائية الأبعاد من بطاقة SIM فائقة الدقة ض- أكوام الخلايا المعالجة بـ 2 أو 3 والنقر باستخدام Cy5 (أحمر) (أشرطة مقياس ، 10 ميكرومتر لبطاقة SIM و 2 ميكرومتر في المنطقة المعبأة). يتم توفير العروض ثنائية وثلاثية الأبعاد في الأفلام التكميلية 1 و 2 ، على التوالي. تمثل الصور ما لا يقل عن خمسة حقول يتم عرضها لكل تكرار باستخدام نسختين تقنيتين على الأقل وأجريت التجربة في أكثر من عشرة مكررات بيولوجية.

تحت التركيز المميت لـ fosfomycin ، دواء مضاد حيوي يمكنه بشكل انتقائي تثبيط إنزيم MurA 45 (الشكل 1 ب) ، بكتريا قولونية لم تكن خلايا MurQ-KU قادرة على النمو بسبب تثبيط التخليق الحيوي الطبيعي لـ UDP-MurNAc (الشكل التكميلي 1). نمو الخلايا بكتريا قولونية يمكن استعادة ΔMurQ-KU في وجود fosfomycin عندما يتم تزويد الخلايا بطريقة بديلة لتركيب UDP-MurNAc عبر مسار AmgK / MurU والسكريات NAM المكملة 13 (الشكل 1 ب ، ج والشكل التكميلي 1). بعد 60-80 دقيقة ، لوحظ أن الخلايا تنمو في وجود 2 تباطأ. نظرًا لأن نمو الخلايا يعتمد على توافر كتل البناء PG ، فقد أضفنا جرعة إضافية من سكريات NAM (12). أدى هذا العلاج إلى استعادة معدل نمو الخلايا (الشكل التكميلي 1 ب). الأهم من ذلك ، أظهر تحليل نمو الخلايا هذا أن لبنات بناء NAM قادرة على الحفاظ على النمو في وجود جرعة قاتلة من fosfomycin. هذا يعني أن الخلية يمكنها بناء PG مع كربوهيدرات NAM المتعامدة بيولوجيًا ، والتي يمكن تعديلها وتصورها لاحقًا.

إعادة التصميم ووضع العلامات بكتريا قولونية PG

لتصور PG ، نمت الخلايا بكمية محسّنة من مشتقات NAM 13. بعد الحضانة (0.2٪ (وزن / حجم) من مشتق NAM ، انظر الطرق والشكلان التكميليان 1 أ و 2) ، تم تطبيق عملية تحميل أزيد ألكين النحاسية اللاحقة المحفزة بالنحاس (I) ، والمعروفة أيضًا باسم تفاعل "النقر" 46 ، على إدخال فلوروفور في بوليمر PG المعاد تشكيله (انظر الطرق). تستكمل الخلايا مع أي منهما 2 أو 3 تم تصنيفها بنجاح باستخدام alkyne أو azide fluorophore Cy5 (AlkCy5 أو AzCy5) أو Rhodamine 110 (Alk488 أو Az488) وتم تصورها من خلال الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية (SIM) 47 (الشكل 3 ب ، الشكل التكميلي 3 أ والأفلام التكميلية 1 و 2) . تمت ملاحظة تسمية الخلفية فقط عندما بكتريا قولونية تم استكمال خلايا ΔMurQ-KU 1 وتعامل تحت ظروف النقر (الشكل التكميلي 4 أ). خلايا بدون إعادة تدوير إنزيمات AmgK و MurU (بكتريا قولونية ΔMurQ-pBBR) و بكتريا قولونية لم يتم تصنيف DH5α بهذه الطريقة (الشكل التكميلي 4 ب ، ج ، على التوالي). أظهرت البيانات لأول مرة أنه يمكن تصور الكربوهيدرات مباشرة في البكتيريا PG.

دراسات الكفاءة / الانتقائية للمسمى بكتريا قولونية PG

قمنا بقياس كفاءة وضع العلامات السكانية للخلايا لطريقة NAM من خلال فرز الخلايا المنشطة الفلورية (الشكل التكميلي 3 ب - هـ). النسبة المئوية ل بكتريا قولونية ΔMurQ-KU سكان الخلايا التي تتألق بعد التضمين مع أي منهما 2 أو 3 متبوعًا بالنحاس (I) المحفز بأزيد ألكين مع الصبغة المترافقة المناسبة ، تبين أنه يزيد عن 87 ٪ من العدد الإجمالي للخلايا عند مقارنتها بعنصر التحكم 1 تخضع لنفس شروط النقر (الشكل التكميلي 3 ب- هـ والجدول التكميلي 4).

لإثبات أن هذه المجسات مضمنة في الواقع في PG ، استفدنا من اختيار المضاد الحيوي fosfomycin من بكتريا قولونية خلايا MurQ-KU (الشكل 1 ب). مع حظر مسار MurA ، يجب أن يأتي مصدر NAM الوحيد المعروف للبكتيريا لبناء PG الجديد من الركائز التي نكملها للخلايا. كما هو موضح سابقا، بكتريا قولونية Δ يمكن استعادة نمو خلايا MurQ-KU والحفاظ عليه في وجود جرعة قاتلة من fosfomycin والسكريات المعدلة 2 أو 3 (الشكل التكميلي 1). علاوة على ذلك ، يوضح الفحص المجهري الفلوري بالاقتران مع فرز الخلايا المنشطة الفلورية النسبة المئوية من بكتريا قولونية ΔMurQ-KU السكان الذين يتألقون انخفض عندما نمت الخلايا في غياب fosfomycin (الشكل 1 ب والشكل التكميلي 5 أ ، ج). لاحظنا انخفاضًا مشابهًا في كفاءة وضع العلامات السكانية عند تصنيفها بكتريا قولونية عولجت خلايا ΔMurQ-KU بجدار الخلية إنزيم الليزوزيم الهضمي ، حيث يُعرف هذا الإنزيم بتحلل PG على وجه التحديد ويرتبط الانخفاض في وضع العلامات بتحلل البوليمر (الشكل التكميلي 5 ب ، د).

لإثبات أن مسبار NAM قد تم دمجه في PG ، أردنا دليل MS. باختصار ، 488 المسمى بكتريا قولونية ΔMurQ-KU نمت الخلايا في حضور 3 عولجوا باستخدام الليزوزيم (انظر الطرق) وتعرضوا للكروماتوجرافيا السائلة عالية الضغط (HPLC) وتحليلات MS عالية الدقة (الشكل التكميلي 6 أ). تمكنا من تحديد وتأكيد شظايا السكاريد أحادية وثنائية ورباعية السكريات المحتملة من PG (مركبات 1317) الموسومة بـ 488 fluorophore (الشكل التكميلي 6 ب ، ج) ، مما يدل على نجاح دمج NAM وتعديل التألق على بكتريا قولونية ΔMurQ-KU PG. شظايا PG 1317 لم يتم العثور عليها في بكتريا قولونية خلايا MurQ-KU تستكمل بـ 1 تحت نفس الظروف. الأهم من ذلك ، منتج الليزوزيم الطبيعي غير الموسوم 18 تم العثور عليه في كلا العلاجين باستخدام 1 و 3، مما يشير إلى أن PG قد تم هضمه بشكل صحيح. منتج الليزوزيم الموسوم بيولوجيًا 19 وجد فقط في العلاج مع 3 (الشكل التكميلي 6 ب ، ج) ، مما يعني ذلك 3 تم دمجها بنجاح في الخلية الكاملة PG ثم هضمها. إن كمية NAMs المعدلة التي يمكن دمجها في PG البكتيرية محدودة بقدرة fosfomycin على تثبيط MurA تمامًا (الشكل 1 ب). إذا افترضنا تثبيطًا كاملاً وتحويلًا كاملاً لتفاعل النقر (الشكل 3 أ) ، فسيتم تصنيف 50٪ من PG بعد مرة مضاعفة واحدة. بعد مرتين مضاعفة ، 75٪ من PG سيتم تصنيفها. ومع ذلك ، يمكن أن تكون النسبة المئوية للتأسيس أقل بسبب تثبيط fosfomycin غير الكامل. علاوة على ذلك ، تشير بيانات MS إلى أن نسبة تسمية النقرات ليست 100٪ (الشكل التكميلي 6 ج). معا ، فحوصات نمو الخلية مع وبدون fosfomycin (الشكل التكميلي 5 أ ، ج) ، ومقايسة هضم الليزوزيم (الشكل التكميلي 5 ب ، د) وبيانات MS (الشكل التكميلي 6 ب ، ج) تدعم الاستنتاج القائل بأن المجسات تقوم بوضع العلامات بكفاءة هذه التجمعات البكتيرية وعلى وجه التحديد دمجها في البكتيريا PG.

وسم البكتيرية سالبة الجرام وإيجابية الجرام PG

لإثبات فائدة الطريقة ، تم تنفيذ استراتيجية وضع العلامات على سلالات بكتيرية إضافية سالبة الجرام. P. putida البكتيريا ، التي تحتوي بشكل طبيعي على إنزيمات AmgK و MurU ، و بكتريا قولونية خلايا DH5α مع AmgK و MurU (بكتريا قولونية KU) بنجاح (الشكل التكميلي 7 أ ، ب). كعنصر تحكم ، P. putida و بكتريا قولونية تستكمل خلايا KU بـ 1 لم يتم تصنيفها (الشكل التكميلي 7 أ ، ب). لتوسيع استراتيجية وضع العلامات هذه إلى السلالات البكتيرية إيجابية الجرام ، أ العصوية الرقيقة سلالة تحتوي على amgK و murU تم بناء مجموعة الجينات (B. الرقيقة 3A38-KU ، طرق). بعد الحضانة مع الفوسفوميسين والمركبات 2 أو 3, B. الرقيقة تم تصنيف خلايا 3A38-KU بنجاح (الشكل التكميلي 7 ج). حضنت الخلايا مع 1 لم يتم تصنيفها (الشكل التكميلي 7 ج). تشير هذه البيانات الأولية إلى أنه يمكن تسمية كل من البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام بطريقة NAM. بالنظر إلى الحفاظ على التخليق الحيوي PG عبر جميع البكتيريا 2 ، فإن استراتيجية وضع العلامات لديها القدرة على تطبيقها على مجموعة واسعة من السلالات البكتيرية ، شريطة أن amgK و murU الجينات موجودة أو يمكن إدخالها.

يكشف الفحص المجهري فائق الدقة عن ميزات PG

على الرغم من الإبلاغ عن طرق أخرى لتصوير PG من خلال إدخال الأحماض الأمينية الفلورية أو استخدام المضادات الحيوية الفلورية ، فإن هذه الطريقة هي الأولى لتصور خصائص الكربوهيدرات في PG. تم استخدام البكتيريا المصنفة لدراسة توزيع ودمج مسبار الكربوهيدرات على مستوى الجزيء المفرد. تم ملاحظة الخلايا النابضة بمشتقات NAM لفترات زمنية مختلفة باستخدام SIM (دقة أفقية 100-140 نانومتر). في 15 دقيقة طول النبض مع 3، كان تراكم إشارة الفلورسنت منخفضًا (الشكل التكميلي 8 أ). بلغ مقدار وتوزيع هذا الملصق الحد الأقصى له بعد 30 دقيقة من طول النبضة (الشكل التكميلي 8 ب). لذلك ، تم استخدام طول النبضة البالغ 45 دقيقة مع السكريات غير الطبيعية لتحقيق أفضل تأثير على الملصقات. من بين هذه الخلايا ، تمكنا من تصور الجليكانات في مجموعة متنوعة من المراحل في دورة انقسام الخلايا البكتيرية (الشكل 4 أ). ومن المثير للاهتمام ، أن حلقة محددة بوضوح من الحاجز PG تم تصنيفها وتصورها (الشكل 3 ب ، الشكل التكميلي 3 أ والفيلم التكميلي 2). يتوافق موقع هيكل الحلقة هذا مع ما تم اقتراحه لـ ض-ring ، بوليمر دائري من FtsZ (متماثل من tubulin) ، والذي يعمل بمثابة سقالة للتجميع المقسم 48. وبالتالي ، يمكن استخدام مجسات NAM لتسمية تخليق PG بواسطة كل من آليات استطالة الخلية وانقسام الخلية ، وستسهل التجارب المستقبلية التي تبحث في التنسيق بين تخليق PG وانقسام الخلية. يبدو أن هذه الحلقة الاستوائية تتقلص مع استطالة الخلايا البكتيرية وتختفي بمجرد اكتمال انقسام الخلية تقريبًا. أثبت التضمين العالي للمسبار فائدته في تصور السمات الهيكلية العالمية لتقسيم الخلايا.

(أ) صور بطاقة SIM لـ 488 مصنفة بكتريا قولونية خلايا ΔMurQ-KU في مراحل انقسام مختلفة للخلايا تم تجميعها من مجموعات عينة خلية منفصلة (شريط مقياس ، 1 ميكرومتر). تمثل الصور ما لا يقل عن خمسة حقول يتم عرضها لكل تكرار باستخدام نسختين تقنيتين على الأقل وأجريت التجربة في ثلاث مكررات بيولوجية على الأقل. (ب) صورة STORM ثلاثية الأبعاد للخلايا المعالجة بـ 3 والمسمى بـ AzCy5 ، عرض كامل الخلية (شريط مقياس ، 0.5 ميكرومتر). يتم توفير العروض ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد في الأفلام التكميلية 3 و 4 ، على التوالي. من الخلية الموضحة في (ب,ج) منظر جانبي لحلقة الحاجز PG و (د) منظر علوي لحلقة الحاجز PG. تم إنشاء جميع الصور وتم حساب المسافات داخل برنامج Zen كما هو موضح في الطرق (أشرطة مقياس ، 0.2 ميكرومتر (ج,د)). Images are representative of a minimum of two fields viewed per replicate with at least two technical replicates and the experiment was conducted in two biological replicates.

To study the fluorescent PG at a higher resolution than SIM, بكتريا قولونية ΔMurQ-KU cells pulsed with 3 for 15 min were imaged using 3D stochastic optical reconstruction microscopy (3D-STORM, 10–20 nm resolution) 49 . The 15 min pulse length was chosen over the 45 min pulse length previously used for SIM, because the high incorporation saturated the finite details of cell wall architecture and shorter time points proved more useful for STORM. Moreover, a short time labelling period (15 min, less than one doubling time (Supplementary Fig. 1)) proves more useful in the study of nascent PG biosynthesis, as the cells would just start to load and incorporate the probes. Evenly distributed fluorescent signals on the cell wall were observed as opposed to the internal cellular environment (Fig. 4b and Supplementary Movies 3 and 4). We were also able to visualize concentrated signals localized in the septal PG-ring with a diameter, from a constricting cell, estimated to be 570 nm (Fig. 4c,d), consistent with what was reported for the ض-ring using labelled FtsZ 50 . From a selected region of the labelled cell, we were able to recognize a network of fluorescent carbohydrate strands that appeared to be interconnected (Supplementary Fig. 9a,b). The side view of this region showed that the fluorescent signal is on the surface of bacterial cells (Supplementary Fig. 9c). In some 3D-STORM images, ring-like structures (ranging from 90 to 180 nm) in the PG were observed (Supplementary Fig. 9d–f and Supplementary Movie 5), indicating that nascent bacterial PG synthesis could follow the pattern of either a circular arrangement of carbohydrate residues or a closed intersecting network of PG chains. This pattern could result from a specific carbohydrate loading process during PG biosynthesis or the presence of protein complexes/lipid rafts. However, the pattern could also be a consequence of incomplete NAM incorporation or click fluorescent labelling (Supplementary Fig. 6). It is possible that smaller carbohydrate rings exist, as we have reached the resolution limit of STORM 51 . Importantly, the STORM control in which بكتريا قولونية ΔMurQ-KU cells pulsed with 1 for 15 min and treated with AzCy5 did not show any substantial signal (Supplementary Fig. 9g).

Tracking of bacterial invasion and breakdown in macrophages

To determine whether this method would be useful in studying the interaction between NAM-based PG fragments and the innate immune system, NAM-labelled bacterial invasion of mammalian cells was studied. Bioorthogonally modified بكتريا قولونية ΔMurQ-KU cells were incubated with J774 macrophage cells and were then subsequently labelled via click chemistry. SIM images confirm that the invasion of modified bacteria into the macrophage cytosol was successfully tracked, while unlabelled bacterial cells were not visualized (Fig. 5, Supplementary Fig 10a,b and Supplementary Movies 6 and 7). A population of macrophage cells contained deformed bacterial cells with released fluorescent fragments (Fig. 5b), which are confirmed to be inside the cells (Supplementary Fig. 10c and Supplementary Movie 8). As time increased, less whole bacterial cells were present inside the macrophage, while more fragments appeared (Supplementary Fig. 11a). We note that it is not clear whether these fragments are generated by macrophage digestion after invasion, or the normal break down of remodelled bacterial cells. When the remodelled bacterial cells were incubated in the DMEM medium in the absence of macrophage, a gradual decrease of bacterial cells was observed, implying that the cells could be degrading (Supplementary Fig. 11b), suggesting that remodelled cells cannot respond to some environmental stresses to the same degree as the wild-type cells. However, we note that the remodelled cells grow well in rich media (Supplementary Fig. 1). This labelling method allows selective tracking of the bacterial cell consumption and specific visualization of glycan units of PG upon macrophage infection, which can be used in future studies towards the identification and characterization of naturally occurring immunostimulatory NAM-containing PG fragments.

(أ) بكتريا قولونية ΔMurQ-KU cells pre-treated with 3 for 45 min were then used to invade J774 cells for 1 h. Cells were fixed and Az488 was clicked into remodelled bacterial PG (green). Whole bacterial cells were visualized as shown with white arrows. Cellular DNA was labelled with 4,6-diamidino-2-phenylindole (blue) (scale bar, 10 μm). (ب) Cells treated as in أ, in which deformed bacterial cells with released fluorescent fragments were visualized as shown with white arrows. Fluorescent images are maximum intensity projections of ض-stacks. Three-dimensional renderings are provided in Supplementary Movies 6 and 8. Images are representative of a minimum of three fields viewed per replicate with at least two technical replicates and invasion experiments were conducted in at least three biological replicates.


Biosynthesis and Degradation

The peptidoglycan biosynthetic pathway begins in the cytoplasm with the synthesis of a muramyl peptapeptide precursor containing a terminal D-Ala-D-Ala. L-Alanine is converted to D-alanine by racemase, with subsequent assembly of D-alanyl-D-alanine by D-Ala-D-Ala ligase. In the cytoplasm, the muramyl pentapeptide precursor is anchored via a water-soluble UDP-glucosamine moiety. In the second phase of peptidoglycan construction, the muramyl pentapeptide N-acetylglucosamine is transferred to a C55 undecaprenyl phosphate with the release of UMP to form a Lipid I intermediate. An additional glycosylation step completes the peptidoglycan unit, which is then transported via its C55 lipid tail to the external periplasmic surface of the membrane, where the peptidyglycan unit becomes integrated into the cell wall matrix. Several transpeptidases and transglycosylases connect the newly formed peptidoglycan structures to the cell wall peptidoglycan matrix.

Inhibitors of peptidoglycan biosynthesis act as antibiotics in that they lead sequentially to the loss of peptidoglycan, loss of cell wall integrity, and lysis. Peptidoglycan degradation is catalyzed by glycosidases, peptidases, and amidases, including lysing enzymes such as lysozyme, that are commonly used for degrading cell walls.

Specific antibacterial compounds that contain a β-lactam structure, such as penicillin, interfere with the synthesis of the cell wall, weakening the peptidoglycan scaffold within the bacterial wall so the structural integrity eventually fails. Since mammalian cells have a plasma membrane but lack the peptidoglycan wall structure, this class of antibacterials selectively targets bacteria with no significant negative effect on the cells of the mammalian host. The specificity of β-lactam antibacterials is due to their structural similarity to the D-alanyl-D-alanine group, allowing them to compete for the binding sites of transpeptidases and prevent the assembly of peptidoglycan layers in both Gram-positive and Gram-negative bacteria.


2.3: The Peptidoglycan Cell Wall - Biology

All bacteria require PGN as a major component providing structural rigor. Pattern recognition receptors from several families determine inflammatory versus inhibitory actions of PGN signature fragments.

PGN is a determinant in setting innate immune parameters and brain function.

In animal models and in tissue from live and postmortem MS brain tissue donors, PGN can be detected in phagocytic cells. In EAE models, PGN promotes inflammation, downstream of NOD receptors. Macrophages, dendritic cells, and neutrophils likely transport PGN from the mucosa to the brain.

The clinical implications of PGN as a central element of the gut–brain axis include the development of novel biomarker assays for monitoring of disease activity and treatment, as well as novel interventions involving immunotherapeutics, dietary intervention, and biotics.

Peptidoglycan (PGN) is a cell wall component of both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Signature fragments of PGN are proinflammatory through engagement of pattern recognition receptors (PRR) on resident tissue cells and circulating leukocytes. Despite its abundance in the gut microbiota, there is limited recognition that PGN could contribute to chronic neuroinflammation. This review highlights current insights into the roles of PGN as a determinant of brain inflammation, notably in multiple sclerosis (MS) and its experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) models. Recent studies demonstrate PGN in blood of healthy adult humans. PGN amplifies autoimmune pathology via activation of innate immune cells. Novel uptake routes through (altered) gut mucosa by myeloid leukocyte subsets promote PGN transport to the brain.


للطلاب والمعلمين أمبير

للمعلمين فقط

التحمل الفهم

EVO-1
Evolution is characterized by a change in the genetic makeup of a population over time and is supported by multiple lines of evidence.

هدف التعلم

EVO-1.A
Describe similarities and/or differences in compartmentalization between prokaryotic and eukaryotic cells.

EVO-1.B
Describe the relationship between the functions of endosymbiotic organelles and their free-living ancestral counterparts.

المعرفة الأساسية

EVO-1.A.1
Membrane-bound organelles evolved from once free-living prokaryotic cells via endosymbiosis.

EVO-1.A.2
Prokaryotes generally lack internal membrane-bound organelles but have internal regions with specialized structures and functions.

EVO-1.A.3
تحافظ الخلايا حقيقية النواة على أغشية داخلية تقسم الخلية إلى مناطق متخصصة.

EVO-1.B.1
Membrane-bound organelles evolved from previously free-living prokaryotic cells via endosymbiosis.


How the peptidoglycan cell wall of Borrelia burgdorferi be used to diagnose, treat, and understand Lyme disease

Brandon Jutras has spent more than a dozen years studying the biology and pathogenesis of Borrelia burgdorferi—the causative agent of Lyme disease. After earning a Ph.D. at the University of Kentucky in B. burgdorferi genetics, Dr. Jutras shifted his focus towards cellular studies on the Lyme disease agent at Yale University, under the supervision of Christine Jacobs-Wagner. Here, seminal studies on the peptidoglycan cell wall of the B. burgdorferi lead to a fundamental understanding of how and when the bacterium grows, and how replication leads to the secretion of arthritis-inducing components. At Virginia Tech, the Jutras lab is expanding the initial work on the cell wall of B. burgdorferi, and using it as a tool to diagnose, understand, and treat Lyme disease.

الملخص

Almost 400,000 Americans are infected with Lyme disease each year. Acute, mild illness can progress into late stage disease, which can cause arthritis, neurological complications, and carditis. The latter can be fatal. The causative agent—Borrelia burgdorferi—is an atypical spirochete that lacks many of the classical virulence factors associated with bacterial infections. We have discovered that Peptidoglycan (PG)— a mesh-like bag that protects the internal contents of the Borrelia burgdorferi cell— is released during growth. Upon release, PG can be detected in the synovial fluid at the site of inflammation in Lyme arthritis patients, months after acute infection. Not only does PG linger in the humans infected with B. burgdorferi, but PG alone is capable of causing arthritis in a mouse model. Virtually all bacteria produce PG, but, as it turns out, the chemical properties of the B. burgdorferi cell wall are extremely unique. In this seminar we will discuss the unique features of B. burgdorferi PG, and how we are exploiting these anomalies to diagnose, treat, and understand Lyme disease.


Correct answer: Peptidoglycan is a chemical compound present in the cell walls of most bacteria. Hence, the correct answer is option (d).

شرح الحل

Reason for the correct answer:

The structures that are found in bacteria are the capsule, outer membrane, cell wall, plasma membrane, pilus, microcompartments, plasmid, endospores, and flagellum. The cell wall of most bacteria is made up of peptidoglycan layer. In Gram-positive bacteria, the cell wall is primarily composed of a thick layer of peptidoglycan. Gram-negative bacteria are surrounded by two membranes: outer thick membrane is made up of lipopolysaccharides and thin peptidoglycan layer.

Option (d) is given as “most bacteria”.

Bacterial cell wall is primarily composed of peptidoglycan. Hence, the correct answer is option (d).

Reason for incorrect answers:

Option (a) is given as, “most viroids”.

Viroids are the smallest infectious entities without a protein coat and cell wall. Hence, option (a) is incorrect.

Option (b) is given as, “most archaea”.

The cell wall of archaea lacks peptidoglycan. Instead it is composed of proteins and polysaccharides. Hence, option (b) is incorrect.

Option (c) is given as, 𠇊ll prokaryotes”.

Archaea and bacteria are included under prokaryotes and as archaea lacks peptidoglycan in their cell walls. Thus, the statement 𠇊ll prokaryotes have peptidoglycan in their cell walls” is not correct. Hence, option (c) is incorrect.

Option (e) is given as, “most eukarya”.

Peptidoglycan is not the component of cell walls of eukarya. Eukaryotic cell walls are composed of polysaccharide such as in plants (cellulose) and fungi (chitin). Hence, option (e) is incorrect.

Hence, the options (a), (b), (c), و (هـ) are incorrect.


Bacterial Cell Division and Peptidoglycan Synthesis: An Evolutionary Enigma

The video above shows the process by which bacterial cells reproduce themselves. Looks simple, doesn’t it? It’s only a colony of cells elongating before splitting in two. Don’t be fooled — appearances can be deceiving. As is so common throughout biology, the apparent simplicity at the macro level masks remarkable complexity at the micro or molecular level.

In eukaryotes, cell division occurs by either meiosis (sex cells) or mitosis (somatic cells). Bacteria, however, undergo neither of those processes (they are asexual and contain no membrane-enclosed organelles or nuclei). Bacterial cell division occurs by a process known as binary fission. Rod-shaped bacteria (e.g. الإشريكية القولونية أو السالمونيلا تيفيموريوم) elongate to twice their original length. This is followed by invagination of the cell membrane, and the formation of a septal ring in the middle (Vicente وآخرون., 2006 Weiss, 2004). The elongated bacterial cell splits down the middle, forming two daughter cells. Some bacteria exhibit variations on this mechanism. For example, in Caulobacter, no septum is formed (Poindexter and Hagenzieker, 1981) and its division is asymmetrical (Judd وآخرون., 2003).

FtsZ Ring Assembly

A family of proteins called Fts proteins are necessary for proper cell division. One of these proteins, FtsZ, is key to cell division and is found ubiquitously in almost all known prokaryotes (Erickson وآخرون., 2010 Margolin, 2005 Romberg and Levin, 2003 Erickson, 1997). There are a few notable exceptions to this generalization, including certain species of the genus Mycoplasma, (Lluch-Senar وآخرون., 2010 Alarcon وآخرون., 2007), Ureaplasma urealyticum (Vaughan وآخرون., 2004 Brown and Rockey 2000 Glass وآخرون., 2000), and the gammaproteobacterial clam symbiont Calyptogena okutanii (Kuwahara وآخرون., 2007).

Cells with mutated FtsZ proteins are unable to divide instead, they yield long filamentous cells (Addinall وآخرون., 1996 Pla وآخرون., 1991). In fact, for this reason FtsZ is a target for antibiotics (Schaffner-Barbero وآخرون., 2012 Ma and Ma, 2012 Margalit وآخرون., 2004). Togther, the Fts proteins build an apparatus for cell division called a divisome (Lutkenhaus وآخرون., 2012 Gamba وآخرون., 2009 Aarsman وآخرون., 2005).

FtsZ is believed to be homologous to tubulin, but this is based largely on structural similarity, since the sequence identity is relatively weak (less than 20% overall). The sequence identity is strongest over the N-terminal GTP-binding domains but is almost completely absent over the C-terminal domains.

The first stage in formation of the divisome is the polymerization of thousands of FtsZ molecules to form a ring, the so-called FtsZ ring (Fu وآخرون., 2010 Adams and Errington, 2009 Stricker وآخرون., 2002). Two additional proteins that are recruited independently of each other, called ZipA and FtsA, function to tether the FtsZ ring to the inner membrane (Huang وآخرون., 2013 Pichoff and Lutkenhaus, 2002 Erickson, 2001). FtsZ ring assembly occurs provided that at least one of those two proteins is present (Pichoff and Lutkenhaus, 2005). ZipA homologues are not found outside the γ-proteobacterial family, but “the requirement for ZipA can be bypassed completely by a single alteration in a conserved residue of FtsA” (Geissler et al., 2003). There is also evidence to suggest that elevated concentrations of FtsA (which is far more widely distributed) can compensate for a lack of ZipA. For example, FtsA is present in significantly higher concentrations in the Firmicute bacterium العصوية الرقيقة than in الإشريكية القولونية (Feucht et al., 2001). Although a particular anchor protein (such as ZipA) is not necessarily required for successful cell division, at least بعض anchor protein is certainly required. I would argue that here we have a case of irreducible complexity, since, unless FtsZ and a tether are present together, the system is useless. Both of these proteins also play a role in the recruitment of other division proteins (Pichoff and Lutkenhaus, 2002).

The FtsZ ring assembles following replication of the bacterial DNA (the nucleoids block FtsZ ring assembly prior to segregation). Location of the cell’s center occurs by a very clever mechanism: Proteins called MinC and MinD oscillate from pole to pole, inhibiting assembly of the FtsZ ring (Dajkovic وآخرون., 2008 Shih وآخرون., 2003 Johnson وآخرون., 2002 Cordell and Lowe, 2001 Shapiro and Losick, 2000 de Boer وآخرون., 1992 de Boer وآخرون., 1989 de Boer وآخرون., 1988). Since the oscillation cycle of MinC and MinD entails that they spend more time at the poles of the cell than the middle, the cell’s center has, on average, a lower concentration of these proteins than elsewhere. Midcell suppression of MinC and MinD is facilitated by an additional protein called MinE (Shen and Lutkenhaus, 2011 Sullivan and Maddock, 2000 Raskin and de Boer, 1997). Consequently, the cell’s mid-point is most conducive to FtsZ ring assembly. As might be expected given its asymmetrical division, there appear to be no homologues of MinC or MinD in Caulobacter (Nierman وآخرون., 2001).

Cell Shape Determination

In addition to those proteins that orchestrate cell division, there are also proteins that determine cell shape. Four significant shape-determining proteins in prokaryotes are MreB, MreC, MreD, and Mbl. Despite low sequence-identity, these proteins are thought to be homologous to actin based on structural similarities (Carballido-Lopez, 2006). For more than a decade, it has been thought that these proteins polymerize into spiral-shaped filaments in the cytoplasm, thereby forming a simple cytoskeleton (White وآخرون., 2010 Divakaruni وآخرون., 2007 Figge وآخرون., 2004 Shih وآخرون., 2003 Jones وآخرون., 2001). This understanding was based on images obtained through fluorescence microscopy. In December of last year, however, an interesting study was published in the Journal of Bacteriology, which called this hypothesis into question (Swulius and Jensen, 2012). Using a technique known as electron cryotomography, the paper’s authors reported that “MreB does in fact form extended helices and filaments in الإشريكية القولونية when yellow fluorescent protein (YFP) is fused to its N terminus but native (untagged) MreB expressed to the same levels does not,” concluding that “the helices are therefore an artifact of the placement of the fluorescent protein tag,” and that “the many interpretations in the literature of such punctate patterns as helices should therefore be reconsidered.” For further discussion, see Margolin (2012): “The Price of Tags in Protein Localization Studies.”

Although the mechanism is not entirely clear, there is definite evidence that these proteins are involved in cellular shape-determination. Inactivating mutations in the genes encoding them result in coccoid-shaped bacteria (Kawai وآخرون., 2009 Bendezu and Boer, 2008 Figge وآخرون., 2004 Doi وآخرون., 1988 Wachi وآخرون., 1987). In fact, naturally coccus-shaped bacteria do not possess a homologue of the mreB gene (suggesting that coccus-shaped bacteria is the default), although it has been reported that MreC and MreD proteins have been characterized and localized in some ovococcus species such as العقدية الرئوية (Land and Winkler, 2011). The rod-shaped bacterium Caulobacter crescentus produces an additional shape-determining protein called crescentin, which is responsible for its characteristic curved morphology (Esue وآخرون., 2010 Kim and Sun, 2009 Ausmees, 2006 M ller-Jensen and Lowe, 2005).

Peptidoglycan Synthesis

Bacteria are divided into two categories based on their response to gram staining, a chemical technique that differentiates bacteria according to the nature of their cell wall. So-called gram-positive bacteria possess a thick cell wall, whereas gram-negative bacteria possess a thinner cell wall. Gram-negative bacteria also characteristically possess a double membrane, whereas gram-positive bacteria possess only a single membrane. Almost all bacteria possess a peptidoglycan cell wall. In gram-negative bacteria, the region between the cell membrane and the cell wall is called the periplasmic space. Gram-positive bacteria possess a smaller periplasmic space between the cell wall and cytoplasmic membrane. Peptidoglycan is composed of ن-acetylmuramic acid and ن-acetylglucosamine, which alternate to form a polymer. These polymers are cross-linked by either a pentapeptide bridge (most gram-positive bacteria) or direct covalent bonding (most gram-negative bacteria) (Schleifer and Kandler, 1972). For a detailed review of peptidoglycan structure and architecture, I refer readers to an excellent review by Vollmer وآخرون. (2008).

Bacterial cell division by binary fission requires the growth of the peptidoglycan cell wall as the bacterium elongates (Amir and Nelson, 2012). In rod-shaped bacteria, the cell wall grows at multiple locations along the cell. In the majority of cocci bacteria, the cell wall grows outward from the FtsZ ring in opposite directions. This process occurs by the severing of the peptidoglycan backbone and the synthesis of new cell wall material. Enzymes called autolysins hydrolyze the β-1,4 glycosidic bonds that link ن-acetylglucosamine and ن-acetylmuramic acid, and the gaps are filled in with additional cell wall material (Zoll وآخرون., 2010 Smith وآخرون., 2000). Since these enzymes can result in programmed cell death, careful regulation is required (Rice and Bayles, 2003 Calamita and Doyle, 2002).
The first stage of re-synthesis of the cell wall is the formation of the peptidoglycan precursors. A chain of five amino acids (a pentapeptide) is added to ن-acetylmuramic acid. ن-acetylglucosamine is subsequently attached to the end of the ن-acetylmuramic acid. The result is a peptidoglycan precursor.

An extremely hydrophobic molecule called bactoprenol bonds to cell wall peptidoglycan precursors, and transports them across the cytoplasmic membrane by making them hydrophobic enough to pass through the membrane. In the periplasmic space, bactoprenol subsequently interacts with transglycosylase enzymes that are responsible for integrating the cell wall precursors into the cell wall and catalyzing the formation of the glycosidic bonds.

The final step of the process is called transpeptidation, the stage of cross-linking. In the case of gram-negative bacteria, this involves the formation of peptide cross-links between diaminopimelic acid and D-alanine on adjacent peptides. In gram-positive bacteria, cross-links typically occur from an L-lysine to a D-alanine of adjacent peptides. At the end of the peptidoglycan precursor, there exists initially two D-alanine residues, but one is removed during the reaction leaving one in the final molecule. A transpeptidase enzyme is responsible for the cross-linking of peptidoglycan. في بكتريا قولونية a specialized penicillin-binding protein called FtsI is the key player in transpeptidation at the septum (Wissel and Weiss, 2004 Wang وآخرون., 1998 Weiss وآخرون., 1997). Localization of FtsI to the septum itself requires an intact N-terminal membrane anchor in addition to the division proteins FtsZ, FtsA, FtsQ, and FtsL (Weiss وآخرون., 1999).

For more detailed reviews of the process of peptidoglycan biosynthesis, I refer readers to Lovering وآخرون. (2012) Barreteau وآخرون. (2008) Hett and Rubin (2008) Heijenoort (2001) and Heijenoort (1998). Be sure to also check out this video animation.

An Evolutionary Enigma

Re-synthesis of peptidoglycan is absolutely essential for viable cell division in virtually all bacteria. How do we know this? The inhibition of peptidoglycan cross-linking is what makes beta-lactam antibiotics — which include penicillins (e.g. ampicillin), cephalosporins and monobactams — so potent as antibacterial agents (Blundell and Perkins, 1981). Penicillin, for example, binds to penicillin-binding proteins, causing them to lose their enzymatic activity. The cell wall is thereby so weakened by the activity of the autolysins that the cell bursts. Some other, non beta-lactam, antibiotics (e.g. lactivicins) have a similar mechanism of action (Macheboeuf وآخرون., 2007).

Cell wall precursors are also targets for antibiotics. For example, the antibiotic nisin associates with cell wall precursor lipid II, and effectively inhibits the peptidoglycan synthesis cycle by locking the cell wall precursor in a stable complex (Muller وآخرون., 2012 Scherer وآخرون., 2011).
Now, here’s the conundrum. Consider the following two observations: (1) Critical to the elongation process is the severing of the peptidoglycan cell wall by the autolysins. (2) Critical to cell viability is the re-synthesis of the peptidoglycan cell wall. This has to be done in a coordinated fashion. Breaking of the cell wall can serve no adaptive utility until a mechanism has arisen for the simultaneous integration of peptidoglycan precursors. Indeed, without the latter mechanism, the cell is rendered non-viable. This is a classic example of what one might describe as an irreducibly complex system.

Observant readers will notice that I cautiously stated that peptidoglycan synthesis is essential for viable cell division in “virtually all bacteria”. As those familiar with the field of microbiology will know only too well, where there is a rule, there are exceptions — and this case is no different. One notable exception to the above generalization is species belonging to the genus Mycoplasma, which lack a peptidoglycan cell wall (Kornspan and Rottem, 2012 Hasselbring وآخرون., 2006 Waites and Talkington, 2004 Razin وآخرون., 1998). This fact, however, has little relevance to explaining the origins of the cell division machinery (including the mechanisms for severing and re-synthesizing peptidoglycan) in bacteria species that فعل possess a cell wall. In any case, Mycoplasma bacteria, although requiring a minimal genome and no cell wall, are obligate parasites. Mycoplasma also live in osmotically protected habitats such as an organism’s body. They also typically possess sterols in their cytoplasmic membrane, imparting to them greater rigidity and strength.

Having considered the complex molecular machinery needed for successful cell division and the biosynthesis of peptidoglycan, ask yourself this question: Is this kind of system amenable to a step-wise Darwinian pathway of incremental modification? The problem outlined above strikes me as a fiendishly difficult challenge to modern evolutionary theory. Add this to the continuously expanding list of macromolecular machines that defy explanation by neo-Darwinian evolution.


شاهد الفيديو: تكون الجدار الخلوي البكتيري (قد 2022).