معلومة

التكيف البارد في البروتينات على المستوى التتابعي والبنيوي

التكيف البارد في البروتينات على المستوى التتابعي والبنيوي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

عند البحث عن التكيف البارد في حقيقيات النوى أحادية الخلية ، لا يوجد الكثير من العمل. في معظم الأحيان ، لا يعطي تحليل التسلسل المقارن للتسلسل العام بين mesophile البحري و psychrophile نتائج واضحة. إذا كنت أخطط للدراسة على المستوى الهيكلي (نمذجة التماثل) ، فهل سأحصل على إجابات؟ ما نوع المعلمات التي يمكنني دراستها؟ البروتينات التي من المتوقع أن توفر تكيفًا باردًا بصرف النظر عن بروتينات الارتباط بالجليد أو البروتينات المضادة للتجمد لأن IBP و AFP لا يمكن العثور عليهما عن طريق مقارنة التسلسل. هل من الممكن إعطاء بعض الأفكار بخصوص هذا؟

شكرا


هناك مجموعات بحثية تعمل على هذا السؤال بالضبط ؛ فهم التكيف البارد في الإنزيمات. يمكنك أن تقرأ عن هذا في العديد من المقالات مثل "حساب التكيف مع البرودة بالإنزيم" ، أو "الأساس الجزيئي الهيكلي للتكيف البارد لـ β-Glucosidase BglU في Micrococcus Antarcticus" ، أو "الأحماض الأمينية المحددة المسؤولة عن التكيف البارد لـ Micrococcus Antarcticus β-glucosidase BglU '

على المستوى العام ، هناك العديد من الخصائص الهيكلية التي توجد عادة. عادة ما تكون أكثر مرونة (أي أقل جسور الملح وغيرها من روابط التثبيت). تأتي المرونة من وجود عدد أقل من الروابط القوية بين سلسلة البولي ببتيد وداخلها ، وحتى احتواء المناطق المضطربة. تعني المرونة أيضًا أنها عادة ما تكون أقل استقرارًا بكثير ، ويصعب التعامل معها. إنها مثيرة للاهتمام من الناحية الصناعية ، حيث إن تطوير الإنزيمات التي يمكن أن تعمل في درجات حرارة منخفضة يمكن أن يقلل من تكلفة تشغيل التفاعلات. هذه في الأساس خطوة نحو صناعة أكثر اخضرارًا. هناك أيضًا تكهنات حول النسب المختلفة ووفرة أنواع الأحماض الأمينية ، ومكان وجودها. سيتعين عليك قراءة مقالات عن بروتينات معينة للتحقق من ذلك.

من وجهة نظر عملية ، عادة ما يتم عزل الإنزيمات المتكيفة مع البرودة من الكائنات الحية الدقيقة في القطب الشمالي ويتم تمييزها في المختبر - من أجل تحديد تحمل درجات الحرارة. ثم يتم حل بنية هذه الإنزيمات (بعد الكثير من العمل) وتشكل الأساس لفهم التكيف مع البرودة.

للإجابة على السؤال بشكل أكثر تحديدًا، لا ، ليس من الواقعي معرفة ما إذا كان شيء ما قد تم تكييفه على البارد مباشرة من خلال النظر إلى تسلسل البروتين (من تلقاء نفسه) ، يجب تحديد ذلك تجريبيًا في المختبر. ومع ذلك ، إذا كان البروتين من كائن حي متكيف مع البرودة (عادةً بكتيريا القطب الشمالي) ، فهناك أسباب تدعو إلى الافتراض أنه بارد ومكيف قبل اختباره في المختبر. يمكنك أيضًا تطبيق بعض المعلومات الحيوية (مثل البحث عن الانفجار) لتحديد ما إذا كانت مرتبطة بالبروتينات المتكيفة مع البرودة. أيضًا ، إذا كان هذا النوع المحدد من البروتين الذي تبحث عنه دراسات جيدة ، فيمكنك أيضًا محاولة عمل نماذج تماثل ومعرفة ما إذا كانت تشبه بنيوياً أقاربها المتكيفة مع البرودة أو ما إذا كانت أكثر تشابهًا بنيويًا مع mesophilic أو حتى محبة للحرارة نظرائه. ومع ذلك ، هذا تخميني للغاية ، ولن أضع الكثير من الوزن على التكيفات المفترضة نظريًا - يجب أن تعرف على الأقل أن البروتين الذي يهمك هو من الكائنات الحية المتكيفة مع البرودة ، حتى تبدأ في البحث (حسابيًا) عن سبب وكيفية ذلك. كن متكيفًا مع البرودة.


التوصيف الجزيئي للتكيف البارد بناءً على تسلسل بروتين تقويم العظام من اهتزاز محيط

مجموعة من 298 عائلة بروتينية من سيكروفيل فيبريو سالمونيكيدا تم تجميعها لتحديد الخصائص الوراثية التي تميزها عن التسلسلات التقويمية من فرع الضمة / الضوئية المتوسطة من غاما بروتيوباكتيريا (اهتزاز أسرة). في استكشافنا المقارن ، استخدمنا أساليب المعلوماتية الحيوية والإحصائية القائمة على المحاذاة. تم العثور على معلومات مثيرة للاهتمام في مصفوفات الاستبدال ، ونمط عدم التناسق في عملية استبدال الأحماض الأمينية. جنبًا إلى جنب مع الاختلاف التركيبي ، حددوا الأحماض الأمينية Ile و Asn و Ala و Gln على أنها تلك التي لها أكبر قدر من التورط النفسي. تم تحسين Ile و Asn بينما يتم قمع Gln و Ala. يتم أيضًا كبت بقايا Pro غير المرنة في مناطق الحلقة ، كما هو متوقع في بنية مرنة. تم أيضًا تصنيف مجموعة البيانات وتحليلها وفقًا للموقع الخلوي المتوقع ، وقمنا بإجراء دراسة إضافية لـ 183 بروتينًا داخل الخلايا و 65 بروتينًا غشائيًا. كشفت النتائج التي توصلنا إليها أن البروتينات المحبة للأمراض النفسية لها مساهمات متشابهة كارهة للماء وشحنة في لب البروتين مثل البروتينات متوسطة المحبة ، في حين أن مساحة السطح المعرضة للمذيبات أكثر كارهة للماء بشكل ملحوظ. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتينات داخل الخلايا (ولكن ليس الغشاء) محبة للنفسية تكون مشحونة بشكل سلبي بدرجة أكبر على السطح. يدعم تحليلنا فرضية تفضيل الأحماض الأمينية الأكثر مرونة على السطح الجزيئي. يبدو أن الحياة في المناخ البارد يتم الحصول عليها من خلال العديد من التعديلات الهيكلية الطفيفة بدلاً من بعض بدائل الأحماض الأمينية.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


خلفية

تسمى الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش في ظل ظروف ممنوعة المتطرفين ، والتي يشير اكتشافها إلى القدرة الفريدة على التكيف لأشكال الحياة البدائية. يتم تصنيف هذه الكائنات الحية الدقيقة وفقًا لظروف نموها المثلى التي توجد فيها مثل حامضيات (تظهر نموًا مثاليًا في ظروف الأس الهيدروجيني الحمضية) ، والقلويات (تزدهر في ظروف الأس الهيدروجيني القلوية) ، والباروفيل (تعيش تحت ضغوط كبيرة) ، والحصوات الداخلية (تعيش في عمق الداخل) الصخور) ، والهالوفيلز (تزدهر بتركيزات عالية من الملح) ، والمركبات النفسية (درجة الحرارة المثلى أقل من 20 درجة مئوية) ، والألواح الحرارية (درجة الحرارة المثلى بين 45-80 درجة مئوية) ، والمحبون للحرارة (درجة الحرارة المثلى أعلى من 80 درجة مئوية) [1]. أكبر تغطية للظروف القاسية المعروفة للمحيط الحيوي للأرض هي أقل من 10 درجات مئوية. على سبيل المثال ، ثلاثة أرباع الأرض مغطاة بالمحيطات ، والتي تحافظ على متوسط ​​درجة حرارة من درجة واحدة إلى ثلاث درجات مئوية. علاوة على ذلك ، فإن مساحات اليابسة الشاسعة في القطب الشمالي والقطب الجنوبي متجمدة بشكل دائم على مدار العام [1]. تشمل الأمثلة القليلة الأخرى لموائل التجميد الصحاري الباردة ، وتربة جبال الألب العالية ، والجليد البحري ، والكهوف الباردة ، والرواسب البحرية ، والتربة دائمة التجمد ، والأنهار الجليدية ، والثلج ، إلخ.

تنتمي غالبية المتسللين المعروفين إلى أنواع مختلفة من العتائق والبكتيريا ، وعدد قليل من أنواع الخميرة والفطريات والطحالب [2]. تتطلب القدرة على الازدهار في التأثيرات المهددة للحياة لدرجات الحرارة المنخفضة ، بالقرب من نقطة تجمد الماء ، مجموعة واسعة من التكيفات من جميع مكوناتها الخلوية ، بما في ذلك أغشيتها وأنظمة توليد الطاقة وآلات تخليق البروتين والإنزيمات التحلل الحيوي والمكونات مسؤول عن امتصاص العناصر الغذائية وما إلى ذلك ، للحفاظ على التمثيل الغذائي ، والحفاظ على النمو والتكاثر المتوافق مع الحياة في ظروف درجات الحرارة المنخفضة هذه [3 ، 4]. بعد أن تطورت مع آليات خاصة ، استعمرت نفسية هذه المنافذ بنجاح [2 ، 5]. تعرض البروتينات المحبة للنفسية متواليات وتركيبات مماثلة لتلك الموجودة في متماثلاتها المتوسطة و (المفرطة) المحبة للحرارة ، وخاصة الإنزيمات مع قدرتها على العمل بكفاءة كمحفزات في درجات حرارة منخفضة [6]. تستدعي القابلية الحرارية لهذه البروتينات عند درجات حرارة معتدلة تطبيقات صناعية هائلة في التكنولوجيا الحيوية ، والمعالجة الحيوية ، والغذاء ، والمنسوجات ، والمنظفات ، والتحفيز الحيوي في ظل ظروف المياه المنخفضة والمنظفات ، إلخ [5-9].

نظرًا للحقائق المذكورة أعلاه ، بدءًا من منتصف السبعينيات ، تم إيلاء الكثير من الاهتمام بشكل أساسي للتسلسل والسمات الهيكلية التي تساهم في تكييف البروتينات (الإنزيمات بشكل أساسي) مع ظروف درجات الحرارة المرتفعة. قارن العديد من الباحثين المعلمات القائمة على التسلسل والبنية بين البروتينات المحبة للحرارة والبروتينات المتوسطة [10]. مع ظهور الجهود الرائدة في أواخر التسعينيات في حل الهياكل ثلاثية الأبعاد للأنزيمات المحبة للتجميد مثل alpha-amylase [11] البروتياز القلوي [12] أيزوميراز ثلاثي الفوسفات [13] نازعة هيدروجين المالات [14] من الكائنات الحية الدقيقة في القطب الجنوبي ، وبسبب حفنة من الهياكل المتاحة في بنك بيانات البروتين (PDB) ، ركزت المجموعات على معالجة الأساس البنيوي للبروتينات في التكيف مع البرودة [4 ، 15-20].

لقد فتحت الزيادة المطردة في تسلسل بروتينات الكائنات المتطرفة العديد من السبل الجديدة لفهم التكيف مع الظروف القاسية [16 ، 21-25]. من الممكن الآن إجراء مقارنة شاملة لتفضيلات الأحماض الأمينية العالمية وأنماط الاستبدال كما يتم استنتاجها من بروتينات الكائنات الحية المختلفة [26-28]. باستخدام متواليات متجانسة ، والتجميع جنبًا إلى جنب مع طرق إحصائية مختلفة ، أجرينا تحليلًا مكثفًا للبروتينات للكائنات الحية الدقيقة المحبة للحيوية ، والميسوفيليك ، والمحبة للحرارة ، والكائنات الحية الدقيقة شديدة الحرارة لفحص الارتباط المحتمل لأنماط استبدال الأحماض الأمينية مع التكيف مع ظروف النمو المثلى لكل منها. في هذه المخطوطة ، نناقش نتائج التحليل المقارن للبروتينات المتسلسلة بالكامل لستة أعضاء من كل من الكائنات المحبة للقلق والمتوسط.


مراجع

فان دن بورغ ، ب.المحبون المتطرفون كمصدر للإنزيمات الجديدة. بالعملة. رأي. ميكروبيول. 6, 213–218 (2003).

جوميز ، جيه & أمبير شتاينر ، دبليو. إمكانات التحفيز الحيوي للأطباء المتطرفين والأطراف المتطرفة. الغذاء تكنول. التكنولوجيا الحيوية. 42, 223–235 (2004).

هوغ ، دي دبليو وأمبير دانسون ، إم جي إكستريموزيمز. بالعملة. رأي. تشيم. بيول. 3, 39–46 (1999).

Danson، M.J & amp Hough، D. W. الأساس الهيكلي للبروتين الملحي. شركات بيوتشيم. فيسيول. أ 117, 307–312 (1997).

Madern، D.، Ebel، C. & amp Zaccai، G. التكييف الملحي للأنزيمات. المتطرفون 4, 91–98 (2000).

Gros، M. & amp Jaenicke، R. البروتينات تحت الضغط. يورو. J. Biochem. 221, 617–630 (1994).

Daniel، I.، Oger، P. & amp Winter، R. أصول الحياة والكيمياء الحيوية تحت ظروف الضغط العالي. تشيم. شركة القس. 35, 858–875 (2006).

Lauro، F. M.، Chastain، R. A.، Blankenship، L. E.، Yayanos، A.A & amp Bartlett، D.H. تعكس جينات الرنا الريباسي 16S الفريدة من أنواع الحيوانات البيزوفيلية كلاً من التطور والتكيف. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 73, 838–845 (2007).

Stetter ، K. O. Extremophiles وتكيفها مع البيئات الحارة. FEBS ليت. 452, 22–25 (1999).

Hurst، L.D & amp Merchant، A. R. المحتوى المرتفع من الجوانين والسيتوزين ليس تكيفًا مع درجات الحرارة المرتفعة: تحليل مقارن بين بدائيات النوى. بروك. R. Soc. لوند. ب 268, 493–497 (2000).

ناكاشيما ، H. ، Fukuchi ، S. & amp Nishikawa ، K. التغيرات التركيبية في الحمض النووي الريبي ، الحمض النووي والبروتينات للتكيف البكتيري مع درجات الحرارة المرتفعة والمنخفضة. J. Biochem. 133, 507–513 (2003).

خاشان ، إيه إن ، تيميس ، كيه إن آند مارتينز دوس سانتوس ، في.أ.ب. محتوى Uracil من 16S rRNA من بدائيات النوى المحبة للحرارة والنفسية يرتبط عكسياً بدرجات حرارة نموها المثلى. نوكل. الدقة الأحماض. 33, 4016–4022 (2005).

Feller، G. & amp Gerday، C. الأنزيمات المحبة للسيكروفيل: موضوعات ساخنة في التكيف البارد. نات. القس ميكروبيول. 1, 200–208 (2003).

D’Amico، S.، Marx، J.C، Gerday، C. & amp Feller، G. علاقات النشاط - الاستقرار في الإنزيمات شديدة الحساسية. J. بيول. تشيم. 278, 7891–7896 (2003).

دياس ، سي. وآخرون. تأثير كارهة للماء ودوره في تمسخ البرد. علم الأحياء المتجمدة 60, 91–99 (2010).

Sicheri، F. & amp Yang، D. S.C. هيكل الربط بالجليد وآلية البروتين المضاد للتجمد من السمك المفلطح الشتوي. طبيعة سجية 375, 427–431 (1995).

Yeh، Y. & amp Feeney، R.E بروتينات مضاد التجمد: هياكل وآليات الوظيفة. تشيم. القس. 96, 601–617 (1996).

Jaenicke، R. & amp Böhm، G. استقرار البروتينات في البيئات القاسية. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 8, 738–748 (1998).

Kumar، S. & amp Nussinov، R. كيف تتعامل البروتينات المحبة للحرارة مع الحرارة؟ زنزانة. مول. علوم الحياة. 58, 1216–1233 (2001).

إنزيمات Vieille، C. & amp Zeikus، G. J. Hyperthermophilic: المصادر والاستخدامات والآليات الجزيئية للاستقرار الحراري. ميكروبيول. مول. بيول. القس. 65, 1–43 (2001).

Berezovsky، I.N & amp Shakhnovich، E. I. الفيزياء وتطور التكيف المحبة للحرارة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 102, 12742–12747 (2005).

Lazaridis ، T. ، Lee ، I. & amp Karplus ، M. علوم البروتين. 6, 2589–2605 (1997).

Kovacic، F.، Mandrysch، A.، Poojari، C.، Strodel، B. & amp Jaeger، K.E. الخصائص الهيكلية التي تحدد التكيف الحراري للإستراتس. هندسة البروتين. ديس. سيل. 29, 65–76 (2016).

دوميني ، ب.ن. ، مينوكس ، إتش آند بروكس ، سي إل إي. أساس إلكتروستاتيكي لاستقرار البروتينات المحبة للحرارة. البروتينات 57, 128–141 (2004).

ميسيمر ، ج. وآخرون. توضح الإنتروبيا التكوينية دور شبكات جسر الملح في ثبات البروتين بالحرارة. علوم البروتين. 16, 1349–1359 (2007).

روكا ، إم ، ليو ، إتش ، ميسير ، بي آند وارسيل ، أ. حول العلاقة بين الاستقرار الحراري والقوة التحفيزية للإنزيمات. الكيمياء الحيوية 46, 15067–15088 (2007).

Bjelic، S.، Brandsdal، B. O. & amp qvist، J. التكيف البارد لمعدلات تفاعل الإنزيم. الكيمياء الحيوية 47, 10049–10057 (2008).

Isaksen، G. V.، Åqvist، J. & amp Brandsdal، B. O. نعومة سطح البروتين هي أصل إنزيم التكيف البارد للتربسين. PLoS Comput. بيول. 8، e1003813 (2014).

Isaksen، G. V.، Åqvist، J. & amp Brandsdal، B. O. إنزيم سطح صلابة يضبط الاعتماد على درجة الحرارة لمعدلات التحفيز. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 113, 7822–7827 (2016).

Åqvist، J.، Wennerström، P.، Nervall، M.، Bjelic، S. & amp Brandsdal، B. O. محاكاة الديناميات الجزيئية للماء والجزيئات الحيوية باستخدام خوارزمية ضغط ثابت مونت كارلو. تشيم. فيز. بادئة رسالة. 384, 288–294 (2004).

Kitchen، D.B، Reed، L.H & amp Levy، R. M. محاكاة الديناميات الجزيئية للبروتين المذاب تحت ضغط مرتفع. الكيمياء الحيوية 31, 10083–10093 (1992).

باسي ، إي. محاكاة الضغط العالي للجزيئات الحيوية. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1595, 185–200 (2002).

Low، P. S.، Bada، J.L & amp Somero، G.N. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 70, 430–432 (1973).

Lonhienne، T.، Gerday، C. & amp Feller، G. الإنزيمات النفسية: إعادة النظر في المعلمات الديناميكية الحرارية للتنشيط قد تفسر المرونة المحلية. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1543, 1–10 (2000).

Siddiqui، K. S. & amp Cavicchioli، R. إنزيمات تكيف الباردة. Annu. القس Biochem. 75, 403–433 (2006).

الحقول ، P. A. & amp Somero ، G.N. البقع الساخنة في التكيف مع البرودة: زيادات موضعية في المرونة التوافقية في تقويمي لاكتات ديهيدروجينيز A4 لأسماك القطب الجنوبي. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 95, 11476–11481 (1998).

Altermark، B.، Niiranen، L.، Willasen، N. P.، Smalås، A. O. & amp Moe، E. فيبريو سالمونيكيدا و mesophilic ضمة الكوليرا. FEBS J. 274, 252–263 (2007).

Liang، Z. X.، Tsigos، I.، Bouriotis، V. & amp Klinman، J. P. تأثير مرونة البروتين على معلمات نقل الهيدريد في نازعات هيدروجين الكحول المحبة للحرارة والنفسية. جيه. تشيم. شركة 126, 9500–9501 (2004).

Daniel، R.M & amp Danson، M.J. فهم جديد لكيفية تأثير درجة الحرارة على النشاط التحفيزي للإنزيمات. اتجاهات Biochem. علوم. 35, 584–591 (2010).

هوبز ، ج. وآخرون. يحدد التغيير في السعة الحرارية لتحفيز الإنزيم الاعتماد على درجة الحرارة لمعدلات الإنزيم المحفز. ACS كيم. بيول. 8, 2388–2393 (2008).

أركوس ، في إل برنتيس ، إي جيه. وآخرون. على الاعتماد على درجة الحرارة لمعدلات تحفيز الإنزيم. الكيمياء الحيوية 55, 1681–1688 (2016).

نجوين ، ف. وآخرون. المحركات التطورية للتكيف الحراري في تحفيز الإنزيم. علم 355, 289–294 (2017).

Elias، M.، Wieczorek، G.، Rosenne، S. & amp Tawfik، D. S. عالمية المعدل الإنزيمي للاعتماد على درجة الحرارة. اتجاهات Biochem. علوم. 39, 1–7 (2014).

بيتريسكو ، آي. وآخرون. الزيلانيز من الخميرة اللاهوائية Cryptococcus adeliae. المتطرفون 4, 137–144 (2000).

Smalås، A. O.، Heimstad، E. S.، Hordvik، A.، Willasen، W.P & amp Male، R. التكيف البارد للأنزيمات: مقارنة بنيوية بين سمك السلمون وتريبسين الأبقار. البروتينات 20, 149–166 (1994).

Olufsen، M.، Smalås، A. O.، Moe، E. & amp Brandsdal، B. زيادة المرونة كاستراتيجية للتكيف البارد. J. بيول. تشيم. 280, 18042–18048 (2005).

Papaleo، E.، Riccardi، L.، Villa، C.، Fantucci، P. & amp De Gioia، L. المرونة والتكيف الأنزيمي مع البرودة: دراسة ديناميكية جزيئية مقارنة لعائلة الإيلاستاز. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1764, 1397–1406 (2006).

باباليو ، إي. وآخرون. مرونة البروتين في التربسين المحب للقلق والمتوسط. دليل على الحفظ التطوري لديناميات البروتين في سيرين بروتياز مثل التربسين. FEBS ليت. 582, 1008–1018 (2008).

Åqvist، J.، Kazemi، M.، Isaksen، G. V. & amp Brandsdal، B. O. Entropy and enzyme catalysis. Acc. تشيم. الدقة. 50, 199–207 (2017).

Kazemi، M. & amp Åqvist، J. آليات التفاعل الكيميائي في محلول من مؤامرات Arrhenius الحسابية للقوة الغاشمة. نات. كومون. 6, 7293 (2015).

Kazemi، M.، Himo، F. & amp Åqvist، J. Enzyme catalysis بواسطة الانتروبيا بدون تأثير سيرس. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 113, 2406–2411 (2016).

Åqvist، J. & amp Kamerlin، S. علوم. اعادة عد. 5, 15817 (2015).

Åqvist، J. & amp Kamerlin، S. ACS كاتال. 6, 1737–1743 (2016).

وارشيل ، أ. النمذجة الحاسوبية للتفاعلات الكيميائية في الإنزيمات والمحاليل (وايلي ، 1991).

Åqvist، J. & amp Warshel، A. محاكاة تفاعلات الإنزيم باستخدام حقول قوة رابطة التكافؤ وغيرها من الأساليب الكمومية / الكلاسيكية الهجينة. تشيم. القس. 93, 2523–2544 (1993).

Snider، MJ، Gaunitz، S.، Ridgway، C.، Short، SA & amp Wolfenden، R. "مذيع الأخبار". الكيمياء الحيوية 39, 9746–9753 (2000).

Outzen، H.، Berglund، G. I.، Smalås، A. O. & amp Willasen، N. P. درجة الحرارة وحساسية الأس الهيدروجيني للتربسين من سمك السلمون الأطلسي (سالمو سالار) بالمقارنة مع التربسين البقري والخنازير. شركات بيوتشيم. فيسيول. ب 115, 33–45 (1996).

Ghanem، M.، Li، L.، Wing، C. & amp Schramm، V.L. الكيمياء الحيوية 47, 2559–2564 (2008).

Isaksen، G. V.، Åqvist، J. & amp Brandsdal، B. O. Thermodynamics of the purine nucleoside phosphorylase reaction التي تم الكشف عنها بواسطة المحاكاة الحاسوبية. الكيمياء الحيوية 56, 306–312 (2017).

Leiros ، H. K. S. ، McSweeney ، S.M & amp Smalås ، A. O. توفر هياكل الدقة الذرية للتربسين نظرة ثاقبة على الضرر الإشعاعي الهيكلي. اكتا Crystallogr. د 57, 488–497 (2001).

Liebschner، D.، Dauter، M.، Brzuszkiewicz، A. & amp Dauter، Z. حول استنساخ التركيبات البلورية البروتينية: خمسة هياكل دقة ذرية من التربسين. اكتا Crystallogr. د 69, 1447–1462 (2013).

بيليسنت فونيل ، إم سي. وآخرون. يحدد الماء بنية وديناميات البروتينات. تشيم. القس. 116, 7673–7697 (2016).

Pucci، F. & amp Rooman، M. القواعد الفيزيائية والجزيئية لاستقرار البروتين الحراري والتكيف مع البرودة. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 42, 117–128 (2017).

Rodriguez-Correa، D. & amp Dahlberg، A.E. دراسات حركية وثرموديناميكية لمركب الببتيدل ترانسفيراز في الريبوسومات من المحبة الحرارية الشديدة ثيرموفيلوس. RNA 14, 2314–2318 (2008).

Siddiqui، K. S.، Cavicchioli، R. & amp Thomas، T. معلمات التنشيط الديناميكي الحراري لبروتينات عامل الاستطالة 2 (EF-2) من العتائق المقاومة للنفسية والحرارة. المتطرفون 6, 143–150 (2002).

ميرلينو ، أ. وآخرون. الهيكل والمرونة في ديسموتازات أكسيد الحديد الفائق التكيف مع البرودة: حالة الإنزيم المعزول من Pseudoalteromonas haloplanktis. J. الهيكل. بيول. 172, 343–352 (2010).

Struvay، C. & amp Feller، G. التحسين لنشاط درجات الحرارة المنخفضة في الإنزيمات المحبة للنفسية. كثافة العمليات جيه مول. علوم. 13, 11643–11665 (2012).

Harms ، M.J & amp Thornton ، J.W. الكيمياء الحيوية التطورية: الكشف عن الأسباب التاريخية والفيزيائية لخصائص البروتين. نات. القس جينيه. 14, 559–571 (2013).

Shoichet، B. K.، Baase، W. A.، Kuroki، R. & amp Matthews، B.W. علاقة بين استقرار البروتين ووظيفة البروتين. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 92, 452–456 (1995).

Dang ، L.X. ، Merz Jr ، K.M & amp Kollman ، P. A. حسابات الطاقة الحرة على استقرار البروتين: Thr-157 → Val-157 الطفرة في الليزوزيم T4. جيه. تشيم. شركة 111, 8505–8508 (1989).

Pan، Y.P & amp Daggett، V. مقارنة مباشرة بين الطاقات التجريبية الخالية من الطي والمحسوبة لطفرات الحذف الكارهة للماء لمثبط الكيموتريبسين 2. الكيمياء الحيوية 40, 2723–2731 (2001).

Seeliger، D. & amp de Groot، B. L. حسابات الثبات الحراري للبروتين باستخدام محاكاة الطاقة الخالية من المواد الكيميائية. بيوفيز. ج. 98, 2309–2316 (2011).

Folch ، B. ، Dehouck ، Y. & amp Rooman ، M. تفاعلات البروتين الحراري والمتوازن التي تم تحديدها بواسطة الإمكانات الإحصائية المعتمدة على درجة الحرارة. بيوفيز. ج. 98, 667–677 (2010).

Pucci، F.، Bourgeas، R. & amp Rooman، M. توقع تغيرات الاستقرار الحراري للبروتين عند حدوث طفرات نقطية باستخدام الإمكانات الإحصائية: تقديم HoTMuSiC. علوم. اعادة عد. 6, 23257 (2016).

Eyring، H. المركب المنشط في التفاعلات الكيميائية. J. كيم. فيز. 3, 107–115 (1935).

Evans، M.G & amp Polanyi، M. بعض تطبيقات طريقة الحالة الانتقالية لحساب سرعات التفاعل وخاصة في المحلول. عبر. شركة فاراداي. 31, 875–893 (1935).

Bjelic، S. & amp Åqvist، J. الحفز وعلاقات الطاقة الحرة الخطية في بروتياز الأسبارتيك. الكيمياء الحيوية 45, 7709–7723 (2006).

راسل ، R.J. ، Ferguson ، J.M ، Hough ، D.W ، Danson ، M.J & amp Taylor ، G.L. Pyrococcus furiosus بدقة 1.9 Å. الكيمياء الحيوية 36, 9983–9994 (1997).

Russell، R.J، Gerike، U.، Danson، M.J، Hough، D.W & amp Taylor، G.L. بنية 6, 351—361 (1998).

Leiros، H. K. S.، Willassen، N.P & amp Smalås، A. O. يورو. J. Biochem. 267, 1039–1049 (2000).

ميريغيتي ، ب. وآخرون. بالقرب من المشهد التوافقي للحالة الأصلية من الإنزيمات المحبة للقلق والمتوسط: فحص نموذج قمع الطي. J. فيز. تشيم. ب. 114, 7609–7619 (2010).

Olufsen، M.، Brandsdal، B. O. & amp Smalås، A. O. جيه مول. رسم بياني. نموذج. 26, 124–134 (2007).

Papaleo، E.، Olufsen، M.، De Gioia، L. & amp Brandsdal، B. O. الأمثل للكهرباء الساكنة كاستراتيجية للتكيف مع البرودة: دراسة حالة للإيلاستازات الباردة والنشطة الدافئة. جيه مول. رسم بياني. نموذج. 26, 93–103 (2007).

ميشتي ، د. وآخرون. دراسة مقارنة للنويدات الداخلية A المتكيفة مع البرودة والدافئة باستخدام تحليلات التسلسل ومحاكاة الديناميات الجزيئية. بلوس واحد 12، e0169586 (2017).

Papaleo، E.، Pasi، M.، Tiberti، M. & amp De Gioia، L. بلوس واحد 6، e24214 (2011).

زانفورلين ، إل م. وآخرون. قلة القلة كاستراتيجية للتكيف مع البرودة: هيكل وديناميكيات GH1 β-glucosidase من Exiguobacterium Antarcticum B7. علوم. اعادة عد. 6, 23776 (2016).

Parvizpour، S.، Razmara، J.، Ramli، A.N M.، Md Illias، R. & amp Shamsir، M.S. جلاسيوزيما أنتاركتيكا PI12. J. كومبوت. بمساعدة مول. ديس. 28, 685–698 (2014).

كيم ، م. وآخرون. التحقيق القائم على الهيكل في الأدوار الوظيفية للحلقة الممتدة ومواقع التعرف على الركيزة في endo-β-1،4-d-mannanase من ذيل الربيع في القطب الجنوبي. كريبتوبيجوس أنتاركتيكوس. البروتينات 82, 3217–3223 (2014).

جاتي لافرانكوني ، ب. وآخرون. يؤدي تطور الاستقرار في إنزيم نشط باردًا إلى استرخاء الخصوصية ويسلط الضوء على التأثيرات المرتبطة بالركيزة على التكيف مع درجة الحرارة. جيه مول. بيول. 395, 155–166 (2010).

Sigtryggsdóttir ، Á. R. ، Papaleo ، E. ، Thorbjarnardóttir ، S.H & amp Kristjánsson ، M. M. يتم تقييم مرونة بروتينات السيرين المتكيفة مع البرودة والحرارة باستخدام تقنية التبريد الفلوري والديناميكيات الجزيئية. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1844, 705–712 (2014).

شي ، ب. وآخرون. تكيف البروتياز المعدني للزنك في عائلة الثرموليسين من أعماق البحار وبكتيريا الجليد البحري في القطب الشمالي التي تم الكشف عنها من خلال الخصائص التحفيزية والهيكلية والديناميكيات الجزيئية: رؤى جديدة للعلاقة بين المرونة التوافقية والترابط الهيدروجين. J. بيول. تشيم. 284, 9257–9269 (2009).

Adekoya، O. A.، Helland، R.، Willassen، N.P & amp Sylte، I. يكشف تحليل التسلسل المقارن والهيكل عن ميزات التكيف البارد لإنزيم في عائلة الثرموليسين. البروتينات 62, 435–449 (2006).


التكيف الهيكلي للليباز RTX نشط بارد من الزائفة ص. تم الكشف عن سلالة AMS8 من خلال مناهج محاكاة التنادد والديناميات الجزيئية

يعد الإنزيم المحب للقلق موضوعًا مثيرًا للدراسة نظرًا لقدرته الخاصة على التكيف مع درجات الحرارة القصوى ، على عكس الإنزيمات النموذجية. باستخدام البرامج المدعومة بالكمبيوتر ، فإن الهيكل والوظيفة المتوقعين لإنزيم الليباز AMS8 (LipAMS8) (معزول عن المحبة النفسية الزائفة sp. ، تم الحصول عليها من تربة القطب الجنوبي). يُظهر الإنزيم أوجه تشابه كبيرة في التسلسل مع الليباز من الزائفة ص. MIS38 و السراتية الذابلة. تساعد أوجه التشابه هذه في التنبؤ بالبنية الجزيئية ثلاثية الأبعاد للإنزيم. في هذه الدراسة ، يتم إجراء محاكاة 12 نانوثانية MD في درجات حرارة مختلفة لتحليل المرونة الهيكلية والاستقرار. أظهرت النتائج أن الإنزيم يكون أكثر استقرارًا عند 0 درجة مئوية و 5 درجات مئوية. من حيث الاستقرار والمرونة ، حافظ المجال الحفاز (N-terminus) على ثباته أكثر من المجال غير التحفيزي (C-terminus) ، لكن المجال غير التحفيزي أظهر مرونة أعلى من المجال الحفاز. يوفر تحليل بنية ووظيفة LipAMS8 رؤى جديدة حول التكيف الهيكلي لهذا البروتين في درجات حرارة منخفضة. يمكن أن تكون المعلومات التي تم الحصول عليها أداة مفيدة للتطبيقات الصناعية ذات درجات الحرارة المنخفضة ولأغراض الهندسة الجزيئية ، في المستقبل القريب.

1 المقدمة

الليباز (المعروف أيضًا باسم ثلاثي أيسيل الجلسرين أسيل هيدرولاز (إي سي 3.1.1.3)) هو سيرين هيدرولاز ، الذي يعمل في ظل ظروف مائية على رابطة إستر الكربوكسيل في ثلاثي الجلسرين لإنتاج الأحماض الدهنية والجلسرين [1]. عرض Lipases مشترك α/β- طيات هيدروليز الموجودة أيضًا في هيدروليز أخرى [2]. يتكون الليباز النموذجي من موقع نشط يتكون من الثالوث التحفيزي للسيرين والجلوتامين / الأسبارتات والهيستيدين [3].

يتم توزيع الليباز على نطاق واسع بين الكائنات الحية ، بما في ذلك البكتيريا وحقيقيات النوى والعتائق كما أفاد Jaeger et al. [4]. في الآونة الأخيرة ، تمت دراسة الليباز التي تنتجها البكتيريا المحبة للنفسية بسبب درجات الحرارة المثلى المنخفضة والأنشطة العالية في درجات حرارة منخفضة للغاية. يقال إن هذا يرجع إلى المرونة الأكبر المتأصلة مقارنة بالإنزيمات المحبة للحرارة والإنزيمات المحبة للحرارة. تتأثر هذه الإنزيمات بشدة بسبب الصلابة الزائدة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخصائص المميزة للإنزيمات اللاهوائية تجعلها مفيدة بشكل خاص كأدوات قيمة لأغراض التكنولوجيا الحيوية وللتحقق من العلاقات المحتملة بين الاستقرار والمرونة والنشاط المحدد [5 ، 6].

ومع ذلك ، فإن تكيف الإنزيم في درجات حرارة منخفضة ليس مفهوماً بشكل كامل لأن هناك القليل من الدراسة حول الإنزيمات اللاهوائية. بعض الميزات التي اكتشفها العلماء تشمل انخفاض عدد جسور الملح ، ونسب أقل قليلاً [Arg / (Arg + Lys)] ، وأعداد مخلفات غير قطبية ، وأعداد أكبر من البقايا غير القطبية المكشوفة [7]. فيما يتعلق بالاستقرار ، فإن الإنزيمات اللاهوائية في الغالب غير مستقرة ، كما ثبت من خلال العديد من المظاهرات ، بما في ذلك التحليل الطيفي الفلوري وتقنيات أخرى. يميل الإنزيم إلى الظهور في درجات حرارة منخفضة ومحتويات حرارية مسعرية [8]. يقترح الباحثون أن إحدى سمات هذه الإنزيمات هي وجود أعداد أكبر من البقايا غير القطبية على أسطحها ، وهو المسؤول عن زعزعة استقرار بنية الماء المحيطة بالإنزيمات. هناك أيضًا عدد أقل من بقايا الأرجينين والبرولين ، مما قد يزيد من مرونة العمود الفقري. لاحظ أن البحث المتعلق بمرونة الإنزيمات اللاهوائية (باستخدام التحليل الطيفي ، والتبريد الديناميكي الفلوري ، ومحاكاة الديناميكيات الجزيئية) قد دعمت فكرة أن زيادة مرونة الإنزيمات المحبة للنفسية ساهمت في تطور الإنزيمات المحبة للنفسية [9].

يتم التأكيد على أهمية فهم التكيفات الهيكلية للأزمات المتطرفة من خلال فائدتها في التطبيقات الصناعية المختلفة. حتى الآن ، تم تصنيف واستخدام عدد قليل فقط من الكائنات الحية شديدة الحساسية ، وخاصة المدمنون على النفس ، كمصادر إنزيمية للعمليات الصناعية. في السابق ، تم فحص سلالة جديدة من البكتيريا المحبة للنفسية (سلالة محددة AMS8) من تربة القطب الجنوبي بحثًا عن نشاط الليباز خارج الخلية وتم تحليلها باستخدام نهج جزيئي. أظهر تحليل 16S rDNA أن سلالة AMS8 كانت مشابهة لـ الزائفة ص. يسمى جين الليباز LipAMS8 تم عزله بنجاح من سلالة AMS8 بإطار قراءة مفتوح يبلغ 1431 نقطة أساس والتي قامت بتشفير بولي ببتيد يتكون من 476 حمض أميني. أظهر هذا الليباز الخام أقصى نشاط عند 20 درجة مئوية. كشفت دراسات وراثية إضافية عن ذلك LipAMS8 يفتقر إلى ببتيد إشارة N-terminal واحتوى على تسلسل غير ببتيد غني بالجليسين والأسبارتات في الطرف C (بيانات تجريبية).

في هذه الدراسة ، تم عزل بنية ووظيفة الليباز من الزائفة ص. تمت دراسة سلالة AMS8 باستخدام البنية المتوقعة باستخدام البرامج المناسبة. تمت دراسة التكيف الهيكلي للإنزيم في درجات الحرارة المنخفضة أيضًا باستخدام المحاكاة الديناميكية الجزيئية (محاكاة MD). نظرًا لأنه إنزيم معزول حديثًا ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة لتوفير مزيد من الفهم والكشف عن إمكانات هذا الإنزيم المحب للقلق ، والذي يمكن استخدامه للأغراض الصناعية والتقنية الحيوية والأساسية.

2. المواد والأساليب

2.1. برمجة

تم تشغيل النمذجة والمحاكاة للهيكل المتوقع للإنزيم على جهاز كمبيوتر واحد (Intel (R) Core RM i5 CPU، 650 @ 3.2 GHz Co، 4.0 GB RAM) مع نظام التشغيل Windows 7 Ultimate. تم تثبيت برنامج تطبيق واقعي اصطناعي علمي آخر (YASARA) [10] على جهاز الكمبيوتر واستخدم في النمذجة الجزيئية ومحاكاة الديناميكيات الجزيئية (MD) للبنية الجزيئية المتوقعة لـ LipAMS8.

2.2. محاذاة تسلسل LipAMS8

يتكون تسلسل الأحماض الأمينية لإنزيم LipAMS8 الذي تم الحصول عليه من NCBI مع رقم المدخل ADM87309 من 476 من بقايا الأحماض الأمينية بوزن 50 كيلو دالتون يستخدم لتحليل التسلسل والنمذجة. حدد برنامج BLAST [11] التسلسل المتماثل الذي له هوية تسلسل عالية مع إنزيم LipAMS8. تم اختيار التسلسل الحاصل على أعلى درجة من هوية التسلسل بناءً على خصائص معينة ، بما في ذلك نوع الأصل وتوافر الهياكل ثلاثية الأبعاد التي تم حلها. بعد ذلك ، تم إجراء محاذاة التسلسل المتعدد باستخدام برنامج Biology Workbench [12] المفتوح مع تسلسل البروتين من السراتية الذابلة [13] و الزائفة ص. MIS38 [14] حيث أن كلا النموذجين يفي بالمعايير المطلوبة كما هو مذكور أعلاه.

2.3 النمذجة المقارنة والتحقق من الصحة

كانت القوالب المستخدمة في النمذجة هي الهياكل البلورية للليباز التي تم الحصول عليها من السراتية الذابلة [13] و الزائفة ص. MIS38 [14]. الإحداثيات الذرية للليباز السراتية الذابلة (معرف PDB: 2qua) و الزائفة ص. تم الحصول على MIS38 (معرف PDB: 2z8x) من بنك بيانات البروتين. تم إنشاء النموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام YASARA [10]. تم إجراء التحقق باستخدام VERIFY3D [15] (لتقييم ملاءمة تسلسل البروتين في هيكله ثلاثي الأبعاد الحالي) ومخطط Ramachandran [16] (لتقييم الجوانب الهندسية للهيكل).

2.4 محاكاة الديناميكيات الجزيئية (MD) بدرجات حرارة مختلفة

قدمت محاكاة MD مزيدًا من المعلومات للنمذجة المجهرية التفصيلية على المقياس الجزيئي. تتبع الطريقة النهج البناء عن طريق محاكاة سلوك الجزيئات باستخدام أنظمة النموذج. تجعل أجهزة الكمبيوتر الأكثر قوة من الممكن دراسة تعقيد أكبر مع توقع واقعي للحصول على معلومات مفيدة وذات مغزى [17].

في هذه الدراسة ، تم إجراء محاكاة MD في الماء. تضمن ذلك محاكاة النموذج المتوقع داخل صندوق مسار مليء بـ 6940 جزيء من المذيب (بما في ذلك كلوريد الصوديوم والماء) و 467 من مخلفات الأحماض الأمينية LipAMS8 عند درجات حرارة 0 درجة مئوية ، 5 درجات مئوية ، 25 درجة مئوية ، 37 درجة مئوية ، 50 درجة مئوية و 100 درجة مئوية. تختلف كثافة الماء باختلاف درجة الحرارة لأن الكثافة النظرية للماء تعتمد على درجة الحرارة.

تم استخدام معامل مجال القوة AMBER03 [18] المطبق في برنامج YASARA لمحاكاة MD. في كل محاكاة ، تم تصغير النموذج الأولي لتقليل فرق منطقة التلامس (CAD) بين نموذج البروتين وجزيء المذيب. أثناء التقليل ، تم استخدام خوارزميات اقتران النسب وأشد النسب.

2.5 تحليل المحاكاة

تمت دراسة الإنزيم باستخدام 240 خطوة محفوظة لكل محاكاة ، والتي تمثل ما يصل إلى 6 نانوثانية من فترة الإنتاج. يوفر التحليل فهمًا أفضل للخصائص الديناميكية للإنزيم في الماء عند درجات حرارة مختلفة. تم حساب جذر متوسط ​​مربع الانحراف (RMSd) للعمود الفقري للبروتين والمخلفات من أجل التحقق من ثبات المسارات. بالإضافة إلى ذلك ، تم حساب تذبذب الجذر التربيعي (RMSf) لكل بقايا من أجل دراسة مرونة المسارات. تم إجراء مزيد من التحليل عن طريق حساب نصف قطر الدوران (Rgyration) ومساحة السطح التي يمكن الوصول إليها بواسطة المذيبات (SASA) للإنزيم خلال 6 نانوثانية (ns) من وقت الإنتاج.

3. النتائج والمناقشة

3.1. النمذجة المقارنة لـ LipAMS8
3.1.1. نمذجة LipAMS8

تبحث محاذاة التسلسل عن قوالب مناسبة لإنشاء بنية ثلاثية الأبعاد للليباز AMS8 (LipAMS8) ، باستخدام النمذجة المقارنة. في هذه الدراسة ، فإن الهياكل البلورية من الزائفة ص. MIS38 الليباز و السراتية الذابلة تم اختيار LipA (التي سجلت 80٪ و 69٪ لهوية التسلسل) كقوالب للنمذجة لأن كلاهما له أعلى الدرجات من هوية التسلسل عند التوافق مع تسلسل LipAMS8. يحتوي كلا النموذجين أيضًا على هياكل قابلة للحل يمكن الحصول عليها من RSCB PDB Data Bank ، وهو أمر مهم للتنبؤ بالبنية ثلاثية الأبعاد للإنزيم.

تم استخدام نموذجين في نمذجة LipAMS8 بطريقة تم تشكيل نموذج من كل قالب ، بالإضافة إلى نموذج هجين تم تشكيله بناءً على أفضل تكوين للبروتين باستخدام النموذجين المختارين. ومع ذلك ، فإن درجة Z لكل نموذج هي المعلمة الأكثر أهمية حيث أن أفضل قيمة درجات Z تم الحصول عليها من كل نموذج تم الحصول عليها ستشير إلى دقة النموذج نفسه وجودته. بعد ذلك ، تم رفض الهيكل الهجين الذي يُتوقع أن يكون أفضل نموذج لـ LipAMS8 بسبب ضعف درجات Z مقارنةً بالهيكل الذي تم الحصول عليه باستخدام الزائفة ص. MIS38 كقالب.

تم التحقق من صحة النموذج باستخدام مؤامرة راماشاندران (الشكل 2). كان النموذج يحتوي على 89.5 ٪ من المخلفات يقيمون في المنطقة المسموح بها الأكثر تفضيلاً. على الرغم من أن أفضل الدرجات هي 90.0٪ وأعلى ، إلا أن الدرجة التي تم الحصول عليها تعتبر مقبولة لأن النموذج هو نموذج تنبؤ وليس بنية بلورية (أي أن الهيكل البلوري عبارة عن هيكل تم حله بالكامل مقارنةً بالتنبؤ به). في دراسة سابقة ، تم اقتراح سيرين للثالوث الحفاز ، الموجود في المنطقة السلبية / غير المسموح بها من مؤامرة راماشاندران ، للتشكيل النشط للإنزيم [19]. ومع ذلك ، من هذه الدراسة ، فإن Ser 207 من الثالوث التحفيزي لـ LipAMS8 يتواجد في المنطقة المسموح بها من مؤامرة Ramachandran. يشير هذا إلى أن الإنزيم موجود في التشكل غير النشط ، والذي يدعمه هيكل الغطاء الملحوظ للإنزيم (التشكل المغلق). يمكن أيضًا التنبؤ بالتشكيل النشط للإنزيم من خلال مراقبة بنية الغطاء.

بالمقارنة مع بنية القالب المستخدمة لنمذجة LipAMS8 كما هو موضح في الصورة المتراكبة في الشكلين 1 (ب) و 1 (ج) ، يعرض النموذج المتوقع لـ LipAMS8 أيضًا منطقتين رئيسيتين: المجال الحفاز (الأخضر) وغير التحفيزي (الأزرق) ، كما هو مبين في الشكل 1 (أ). المجال الحفزي في N- محطة غنية α الحلزونات ، بينما يهيمن على المجال غير التحفيزي في المحطة C β- خيوط. يُظهر المجال التحفيزي أيضًا وجود ملف α/βثنية هيدروليز والثالوث التحفيزي ، والذي يتضمن بقايا Ser 207 و His 255 و Asp 313. يظهر Ser 207 في خماسي الببتيد الخاص بزخارف G-X-S-X-G (حيث يمثل X سيارته 206 و Leu 208) ويقع عند المنعطف الحاد بين β-ستراند و α- الحلزون الذي يشبه الكوع النواة (موجود عادة في عائلة بنيوية α/βهيدروليسات) [20]. يشير هذا إلى أن السيرين التحفيزي يتم دعمه من خلال ثقب الأكسجة الذي يعمل على استقرار الشحنة السالبة المتولدة أثناء هجوم محب للنيوكليوفيلي بواسطة Ser O.γ [19].


(أ)
(ب)
(ج)
(أ)
(ب)
(ج) (أ) توقع LipAMS8 بنية ثلاثية الأبعاد. يتكون الهيكل من المجالات التحفيزية (الخضراء) وغير التحفيزية (الزرقاء). الغطاء ملون (أحمر). (ب) و (ج) عبارة عن تراكب لبنية LipAMS8 (أرجواني) مع 2QUA (فضي) و 2Z8X (أصفر).


مؤامرة راماشاندران لهيكل LipAMS8 3D. سجل الهيكل 89.5٪ ، مما يعني أن 89.5٪ من المخلفات تقطن في المنطقة الأكثر تفضيلاً.

بشكل عام ، يمكن أن يوجد الليباز في حالتين تشكيليتين: نشط وغير نشط. يحدد شكل الغطاء (مفتوح أو مغلق) ما إذا كان الإنزيم في الشكل النشط أو غير النشط. يعتبر التكوين النشط للليباز ضروريًا للنشاط التحفيزي [19]. في هذه الدراسة ، يوجد هيكل يشبه الغطاء يغطي الموقع التحفيزي في المجال الحفزي ، مما يوحي بالتشكيل غير النشط للإنزيم. اقترحت الدراسات السابقة أن الشكل النشط للإنزيم له غطاء مفتوح ، مما يسمح بدخول الركيزة إلى موقع الربط للتحفيز [21]. وبالتالي ، فإن الشكل المغلق للغطاء في هذه الدراسة يعني أن النوكليوفيليك Ser 207 لا يمكنه مهاجمة الركيزة.لفتح الغطاء ، يلزم وجود واجهة بين الزيت والماء بحيث يمكن تعديل الغطاء للكشف عن موقع الحفاز ، مما يوفر الوصول إلى الجيب التحفيزي للركائز [19]. هذا يعزز نشاط LipAMS8. يحتوي الغطاء رقم 1 من LipAMS8 على عدد كبير من المخلفات الكارهة للماء ، بما في ذلك Ala 51 و Leu 53 و Val 54 و Val 57 و Val 58. قد يسمح هذا بالتفاعل الفعال بين بقايا الغطاء الكارهة للماء مع واجهة الدهون ويساهم في فتح الغطاء بسهولة.

من هذه الدراسة ، يتكون LipAMS8 من أشكال RTX في المجال غير التحفيزي ، مما يشير إلى أن LipAMS8 هو أحد ليباز RTX الذي ينتمي إلى عائلة I.3 الفرعية. تم إثبات ذلك أيضًا من خلال عدم وجود بقايا السيستين [22]. لاحظ أن شكل RTX موجود في مجموعة متنوعة من الكائنات الدقيقة سالبة الجرام [6]. يوجد هذا الشكل (المكون من متواليات غير ببتيد غنية بالجليسين) عادةً في الجزء الكربوكسي الطرفي من الإنزيم [22]. في البنية ثلاثية الأبعاد لـ LipAMS8 ، شكل تسلسل أشكال RTX التوازي β- التمرير ، حيث يتم إرفاق أول 6 بقايا من كل شكل عزر أيونات الكالسيوم (Ca 2+). البقايا الثلاثة المتبقية تكون قصيرة β- الخيوط ، والتي ينتج عنها الحلزون الأيمن من β- الخيط على المجال غير التحفيزي. تظل الوظيفة الدقيقة لأشكال RTX غامضة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون مجالات ربط المستقبلات ، ومحسنات الإفراز ، والمرافقين الداخليين [6].

في النموذج المتوقع لـ LipAMS8 ، توجد أيونات معدنية ، بما في ذلك 6 ذرات من Ca 2+ وذرة واحدة من Zn 2+. لاحظ أن أيونات المعادن مطلوبة بواسطة جزء كبير من الإنزيمات لأداء نشاط تحفيزي. قد تساهم أيونات المعادن أيضًا في تنشيط الركيزة والتثبيت الكهروستاتيكي لبنية الإنزيم. في هذه الدراسة ، يتفاعل Asp 128 و Asp 130 و ligand في مواقع ربط Zn 2+. لا يوجد Zn 2+ الموجود في LipAMS8 هذا في الموقع التحفيزي ، لذلك قد لا يساهم في النشاط التحفيزي للإنزيم. إلى جانب مساهمتها في النشاط التحفيزي ، قد تضمن الأيونات الاستقرار الهيكلي المحلي والشامل ، على غرار وظيفة ثاني كبريتيد [23]. في الختام ، هناك أيونات معدنية في البنية المتوقعة لـ LipAMS8 ، والتي قد تساهم في الاستقرار الهيكلي العام. ومع ذلك ، لوحظ أن الإنزيم يحتوي على القليل من الأرجينين أو لا يحتوي على أي أرجينين مقارنةً باللايسين ، ومحتوى البرولين المنخفض ، ونقص جسر الملح ، مما يساهم في تكييف الإنزيمات المحبة للنفسية عند درجات الحرارة المنخفضة. بالإضافة إلى ذلك ، من المتوقع أن يتمتع الإنزيم بمرونة أعلى مقارنة بالأنزيمات المتوسطة أو المحبة للحرارة ، مما يسمح للأنزيمات المحبة للنفسية أن تكون نشطة بتكاليف طاقة منخفضة [7].

3.1.2. المحاكاة الديناميكية الجزيئية (MD)

تم إجراء محاكاة MD للكشف عن التغيرات في بنية ومرونة وديناميكيات LipAMS8 عند محاكاتها في درجات حرارة مرتفعة. اقتصر أخذ العينات المطابقة على 12 نانوثانية. لقد تم اقتراح أن LipAMS8 هو إنزيم نشط بارد. لذلك ، يجب أن يتغير الهيكل أو يتكشف مع زيادة درجة الحرارة من 25 درجة مئوية إلى 100 درجة مئوية بسبب اضطراب القوى بين الجزيئات ، بسبب الزيادة في الطاقة الحركية عند درجات الحرارة المرتفعة. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، لم يكن هناك الكثير من الكشف عن البنية الثانوية حتى عندما يتم محاكاة الإنزيم عند درجة حرارة أعلى. قد يكون هذا بسبب محدودية أخذ العينات المطابقة ، والتي هي بحد أقصى 12 نانوثانية. قد يلزم إطالة وقت المحاكاة لرؤية التغييرات الهيكلية.

3.1.3. تحليل بيانات محاكاة الديناميات الجزيئية

قيم الجذر التربيعي المتوسط ​​للانحراف (RMSd) لذرات العمود الفقري في النماذج الأولية تقيم تقارب نظام البروتين. في هذه الدراسة ، تظهر قيم RMSd من هيكل النموذج المصغر المتوقع أثناء محاكاة MD عند 0 درجة مئوية و 5 درجات مئوية و 25 درجة مئوية و 37 درجة مئوية و 50 درجة مئوية و 100 درجة مئوية في الشكل 3. عند 5 درجات C ، يبقى البروتين شبيهاً بالأصلي ويتوازن بمتوسط ​​1.83 Å من الهيكل المصغر. يشير هذا إلى استقرار الإنزيم عند 5 درجات مئوية. مقارنة بـ 5 درجات مئوية ، أظهرت قيمة RMSd عند 0 درجة مئوية أن البنية ثلاثية الأبعاد للبروتين تصبح غير مستقرة عندما تصل إلى 1000 ps. تبدأ قيمة RMSd في التذبذب إلى قيم أعلى من 2 Å وحتى تصل إلى قيمة 3.45 Å عند 2525 ps. انخفضت القيمة إلى 1.807 Å عند 3675 ps وارتفعت إلى أعلى من 2 Å عند 4000 ps. يتوافق التقلب غير المستقر في RMSd مع الاختلاف في عناصر البنية الثانوية التي لوحظت أثناء المحاكاة. ومع ذلك ، لوحظ الاستقرار الهيكلي بعد 5500 ps حيث يتم الحفاظ على نمط تذبذب RMSd ولا يتباعد أكثر من 2 Å في نهاية المحاكاة عند 12 نانوثانية.


زاد اتجاه التذبذب لاستقرار الإنزيم عند 25 درجة مئوية ، و 37 درجة مئوية ، و 50 درجة مئوية ، و 100 درجة مئوية في القيمة خلال المحاكاة مع بقاء قيم RMSd أعلى من 4.0 Å عند 3000 رطل لكل بوصة مربعة لبقية فترة المحاكاة. تدعم البيانات التجريبية الحالة غير المستقرة لهذا الإنزيم ، والتي وجدت أن نشاط إنزيم LipAMS8 انخفض عندما زادت درجة الحرارة فوق 25 درجة مئوية. من الدراسة ، نستنتج أنه عند 25 درجة مئوية ، و 37 درجة مئوية ، و 50 درجة مئوية ، و 100 درجة مئوية ، يفقد الهيكل العالمي ثلاثي الأبعاد للبروتين هيكله الأصلي من أجل تكييف الجزيء مع التغيرات في درجة الحرارة وكثافة الماء ( المذيب). وبالتالي ، تشير هذه النتيجة إلى أن التغييرات في الإحداثيات الهندسية وتكشف البروتين ناتجة عن انخفاض استقرار النظام.

استنتجنا أن درجات الحرارة الأكثر ثباتًا لـ LipAMS8 المحاكية في الماء هي 0 درجة مئوية و 5 درجات مئوية لأن درجة الحرارة المنخفضة تعزز حركة أقل توافقية مع الحفاظ على السلامة الهيكلية والاستقرار. من ناحية أخرى ، بالنسبة لدرجات الحرارة التي تتراوح بين 25 درجة مئوية و 100 درجة مئوية ، فإن بنية الإنزيم غير مستقرة وتنحرف بشكل كبير عن هيكلها الأولي. قد يكون الانحراف الأعلى لبنية الإنزيم عند محاكاته في الماء عند 25 درجة مئوية إلى 100 درجة مئوية مرتبطًا باضطراب القوى الجزيئية ، مما يؤدي إلى زيادة الأنشطة الحركية للجزيئات. ومع ذلك ، فإن التغييرات الهيكلية للإنزيم المحاكى في الماء ليست بهذه الأهمية عند مقارنتها بالتغيرات الهيكلية التي تحدث عند محاكاة الإنزيم في مذيب عضوي [24].

ومن المثير للاهتمام ، أن متوسط ​​درجات RMSd لـ 0 درجة مئوية و 5 درجات مئوية كان ثابتًا خلال المحاكاة. ومع ذلك ، تم تكييف الاستقرار فقط مع المجال التحفيزي للإنزيم الذي يعتقد أنه يتعزز من خلال وجود أيونات معدنية مثل Zn 2+ و Ca 2+. من ناحية أخرى ، فإن الحالة غير المستقرة لهذا الإنزيم والتي تساهم في المرونة العالية للمجال غير التحفيزي عند درجة حرارة منخفضة مثل 0 درجة مئوية و 5 درجات مئوية يمكن التنبؤ بها بطريقة ما لأن الإنزيم يجب أن يضبط نفسه نحو درجة الحرارة المنخفضة حيث الطاقة تنخفض ببطء. إذا لم يزيد الإنزيم من مرونته في هذه المرحلة ، فقد يصبح الهيكل صلبًا جدًا ولا يمكن أن يعوض انخفاض درجة حرارة التحفيز.

يوضح الشكل 4 تقلبات جذر متوسط ​​التربيع (RMSf) لكل بقايا لـ LipAMS8 في الماء عند درجات حرارة من 0 درجة مئوية إلى 100 درجة مئوية. يتراوح متوسط ​​درجات RMSf لكل بقايا لجميع درجات الحرارة من 1.12 إلى 4.1 Å. أعلى درجة تقلب عند 100 درجة مئوية. هذه النتيجة تعادل تأثير ارتفاع درجة الحرارة على مرونة الإنزيم. ومع ذلك ، عند مقارنة مرونة الإنزيم عند 0 درجة مئوية و 5 درجات مئوية ، انخفضت قيمة RMSf من 1.43 إلى 1.12 Å. قد تشير المرونة العالية للإنزيم عند درجة الحرارة المنخفضة إلى تكيف الإنزيم لمواجهة "تأثير التجميد" مع انخفاض درجات الحرارة.


في الموقع التحفيزي ، لا تشير درجات RMSf إلى مرونة أعلى للمخلفات التي تمت محاكاتها في الماء عند درجات حرارة مختلفة. يتم الحفاظ على المرونة عند قيمة أقل من متوسط ​​درجة RMSf في درجات حرارة مختلفة. يشير هذا إلى أن استقرار الثالوث الحفاز مدعوم برقم RMSd لكل بقايا.

بشكل عام ، كان نمط التقلب لكل بقايا مشابهًا للنمط الموضح في الشكل RMSd لكل بقايا. يوضح كلا الشكلين أن التقلبات الأعلى تحدث في المجال غير التحفيزي. حدث التقلب الأكثر اتساقًا عبر درجات الحرارة عند البقايا 393-476 ، التي توجد في المجال غير التحفيزي حيث يوجد تكرار RTX. قد تحدث مرونة المجال بسبب وجود بقايا عالية من الجلايسين ، والتي من المعروف أنها تقدم المرونة في بنية البروتين لأنها تفتقر إلى السلاسل الجانبية [25]. قد تعني المرونة المتزايدة لـ LipAMS8 (التي نشأت من الاستقرار المنخفض للمجال غير التحفيزي) أن المجال غير التحفيزي هو الجزء الحاسم من التركيب الجزيئي لـ LipAMS8. قد يساهم هذا المجال في ارتفاع نشاط الإنزيم عند درجة حرارة منخفضة.

يكشف فحص المرونة الهيكلية لهيكل الغطاء أن الغطاء رقم 1 ، الذي يتكون من بقايا 51-58 ، لا يحتوي على درجة أعلى من متوسط ​​RMSf في أي درجة حرارة. ومع ذلك ، فإن الغطاء رقم 2 ، الذي يتكون من المخلفات 148-167 ، له تقلبات عند المخلفات 148-153 في معظم درجات الحرارة. هذا يثبت مرونة بقايا الغطاء عند محاكاته في الماء عند درجات حرارة مختلفة. أدت هذه النتيجة إلى فرضية أن الغطاء رقم 2 لـ LipAMS8 قد يكون قادرًا على الخضوع لعملية انتقال مطابقة في ظل الظروف المناسبة ، مثل وجود ركائز. قد تعمل البقايا 148-153 الموجودة على الغطاء رقم 2 ، والتي تكون أكثر مرونة ، مثل الحامل الذي يفتح هيكل الغطاء لفضح موقع الربط في التنشيط البيني. على عكس الغطاء رقم 1 ، فإن الغطاء رقم 2 أكثر مرونة. وبالتالي ، قد يكون الغطاء رقم 2 هو الغطاء الأول الذي يتم فتحه عند وجود ركائز. تكون واجهة زيت الماء حول فتحة الغطاء الأول أقل مرونة لربط الركيزة بالموقع التحفيزي. لاحظ أن فتح الغطاء هو خطوة حاسمة في الليباز بهيكل يشبه الغطاء. تعتبر مرونة المخلفات الموجودة في هيكل الغطاء مهمة لتحديد معدل حركة الغطاء ، والذي يلعب دورًا مهمًا في تكييف وظيفة الإنزيم في درجات الحرارة المنخفضة [7].

قد تقل المرونة الهيكلية التي تمت ملاحظتها على بنية LipAMS8 ، التي تمت محاكاتها في الماء عند درجات حرارة مختلفة ، إذا تمت محاكاتها في مذيب عضوي. تشير دراسة سابقة إلى صلابة أعلى للإنزيم في المحلول العضوي [26]. ومع ذلك ، لا يوجد الكثير من المعلومات المتاحة على المستوى الجزيئي لقبول أو رفض الاقتراح. للتحقق من المرونة الهيكلية للإنزيم في كل من البيئات المائية وغير المائية ، هناك حاجة إلى مزيد من المحاكاة لمقارنة الأساس الهيكلي للإنزيم.

يتم استخدام تحليل جذر متوسط ​​التربيع (RMSf) لكل بقايا وجذر متوسط ​​الانحراف التربيعي لكل بقايا (RMSd) لذرات العمود الفقري لتحليل التقلبات الذرية للنموذج المتوقع لـ LipAMS. يوضح الشكل 5 RMSd لكل بقايا عند 0 درجة مئوية و 5 درجات مئوية و 25 درجة مئوية و 37 درجة مئوية و 50 درجة مئوية و 100 درجة مئوية. متوسط ​​RMSd لجميع المخلفات ، بما في ذلك المخلفات النهائية ، يقيس نوعياً مرونة البروتين للعلاقة بين المرونة والديناميكيات المطابقة للبروتين.


من البيانات ، قيم متوسط ​​RMSd للمخلفات هي نفسها تقريبًا بين 0 درجة مئوية و 5 درجات مئوية. ومع ذلك ، عند 25 درجة مئوية و 37 درجة مئوية و 50 درجة مئوية و 100 درجة مئوية ، يزيد متوسط ​​قيم RMSd إلى 6.29 درجة مئوية. يتشابه نمط قيم متوسط ​​RMSd للمخلفات مع القيم المتوسطة لجذر متوسط ​​تذبذب التربيع (RMSf) في جميع درجات الحرارة.

حدث انحراف الهندسة الهيكلية للإنزيم بشكل رئيسي في المجال غير التحفيزي. قيم RMSd لكل بقايا عند البقايا 412-425 و 436-470 أعلى من متوسط ​​درجة RMSd عند كل درجة حرارة. من هذا ، فإن زعزعة استقرار الإنزيم لا تشمل البروتين بأكمله كما اقترحت إحدى الدراسات [19]. بدلاً من ذلك ، قد يؤدي عدم استقرار الإنزيم إلى جزء من الإنزيم (كما لوحظ في هذه الدراسة). بالإضافة إلى ذلك ، رفضت البيانات أيضًا الافتراض القائل بأن زعزعة استقرار الإنزيم يحدث غالبًا في المجال التحفيزي [8]. يحدث زعزعة استقرار الإنزيم في الغالب في المجال غير التحفيزي ، وقد يكون ذلك بسبب وجود بقايا تسبب فقدانًا في استقرار بنية الإنزيم ثلاثية الأبعاد. ومن المثير للاهتمام،

-رول يقترح للحفاظ على استقرار الزائفة ص. MIS38. سيؤدي الحذف والتعديل والطفرة في هذا التمرير الذي يتكون من وجود أشكال RTX و Ca 2+ إلى تغييرات في التشكل الهيكلي وتمسخ للإنزيم. ومع ذلك ، اقترحنا أن عدد مرات تكرار RTX أقصر / أقل ، وعدد أقل من أيونات المعادن في هذا النظير الزائفة ص. MIS38 ، قد يكون السبب وراء قدرة LipAMS8 على التكيف في بيئة شديدة البرودة.

تُظهر دراسة المجال التحفيزي أن Asp 128 و Asp 130 ، اللذان يتفاعلان مع Zn 2+ ، لهما RMSd لكل قيم بقايا أعلى من متوسط ​​درجات RMSd في كل درجة حرارة. وبالتالي ، فإن Asp 128 و Asp 130 من بين تلك البقايا التي تتقلب وتحرك التكيف مع درجة الحرارة. ومع ذلك ، فإن نسب تذبذب Asp 128 و Asp 130 إلى متوسط ​​درجات RMSd في كل درجة حرارة تنخفض مع زيادة درجة الحرارة. وهذا يعني زيادة التفاعل بين المعادن و Asp 128 و Asp 130 في درجات حرارة أعلى. تتفق هذه النتيجة بشدة مع دراسة سابقة ، والتي اقترحت أن Zn 2+ يعزز الاستقرار الهيكلي في التكوين النشط للإنزيم في درجات حرارة مرتفعة [27]. تشير هذه النتيجة إلى احتمال أكبر لتكيف الإنزيم في درجات حرارة أعلى ، خاصة في المجال التحفيزي لأن Zn 2+ يعمل على استقرار بنية الإنزيم.

كما هو مبين في الشكل 4 ، يتم الحفاظ على الدرجات الخاصة بتلك البقايا التي تتفاعل مع Ca 2+ في المجال الحفزي. يشير هذا إلى أن المعدن يساهم في استقرار المجال التحفيزي بحيث لا ينحرف الهيكل عن هيكله الأولي. تتوافق هذه النتيجة مع وظيفة Ca 2+ في الاستقرار الهيكلي للليباز المقترح في دراسة سابقة لـ B. glumae الليباز [28]. البيانات التجريبية ، حول تأثير الكالسيوم على نشاط LipAMS8 ، دعمت أيضًا فكرة أن Ca 2+ قد تعزز الاستقرار الهيكلي للإنزيم. وبالتالي ، يتم الحفاظ على الخصائص الأنزيمية وتحسين النشاط التحفيزي لتوفير عائد أكبر. على عكس البقايا التي تتفاعل مع Ca 2+ في المجال الحفزي ، فإن Ca 2+ في المجال غير التحفيزي لها قيم أعلى من RMSd و RMSf ، مما يشير إلى زعزعة الاستقرار ومرونة البقايا. لا تتفق مساهمة Ca 2+ في استقرار البقايا مع الاقتراح القائل بأنها تعزز الاستقرار. قد تكون درجات RMSd و RMSf للبقايا التي تتفاعل مع Ca 2+ في المجال غير التحفيزي ناتجة عن عملية التكيف من Ca 2+ بحيث يظل المجال الحفزي مستقرًا. هذا يمنع المجال التحفيزي ، المسؤول عن النشاط التحفيزي ، من الانكشاف والخلل الوظيفي بسبب التغيرات في الاستقرار والتكوين الهيكلي.

يوضح الشكل 6. نصف قطر الدوران (Rgyration) للإنزيم عند درجات حرارة مختلفة ضمن المسارات عند 12 نانوثانية. توفر المعلمة معلومات عن ميل هياكل البروتين للتوسع أثناء المحاكاة الديناميكية. عند 5 درجات مئوية ، يتم الحفاظ على درجة Rgyration طوال فترة المحاكاة مقارنة بدرجة Rgyration للإنزيم عند محاكاتها في درجات حرارة أعلى وأقل. أعلى درجة لنصف قطر دوران LipAMS8 عند 25 درجة مئوية ، زادت النتيجة إلى 27.128 Å خلال 12 نانوثانية من المحاكاة. ويلي ذلك درجات درجات الحرارة الأخرى باستثناء الدرجة عند 5 درجات مئوية. يشير هذا إلى تكيف بنية الإنزيم لمنع فقدان الترابط الأصلي للهيكل عند درجة حرارة منخفضة. بشكل عام ، تكون النتيجة متناسبة مع انحراف بنية الإنزيم ، كما هو موضح في الشكل 3. بينما تشير SASA إلى نقل الطاقة الحرة المطلوبة لنقل البروتين من مذيب مائي إلى مذيب غير قطبي [29] ، كما هو موضح في الشكل 7 ، فإن تظهر درجات SASA عند 5 درجات مئوية و 0 درجة مئوية نمط التذبذب ، والذي يتم الحفاظ عليه طوال 12 نانوثانية من المحاكاة. بالمقارنة مع 25 درجة مئوية ، يزداد الرقم ، مما يشير إلى ظهور الإنزيم خلال فترة المحاكاة. يتناسب ظهور الإنزيم عند درجة الحرارة هذه مع التغيرات الهيكلية للبنية الثانوية للإنزيم. لوحظت الزيادة في درجة SASA أيضًا في درجات حرارة 37 درجة مئوية و 50 درجة مئوية و 100 درجة مئوية.


المواد والأساليب

الإفراط في التعبير عن البروتين وتنقيته

ال Eaتم تحويل ناقل التعبير BglA-pET28a إلى الإشريكية القولونية خلايا BL21 (DE3) (Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، الولايات المتحدة الأمريكية). نمت الخلايا في 1 لتر من وسط LB عند 37 درجة مئوية وتم إحداث تعبير عن البروتين باستخدام 0.4 ملي مولار من الأيزوبروبيل -D- ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. تم حصاد الخلايا بالطرد المركزي عند 7000 خلية xg (20 دقيقة ، 4 درجات مئوية) ، معلق في المخزن المؤقت A (20 ملي فوسفات الصوديوم ، 500 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي إيميدازول ، درجة الحموضة 7.5) ، مع 1 مم PMSF ، ومحلول بعلاج الليزوزيم يليه صوتنة. تم توضيح مستخلص الخلية بالطرد المركزي (20.000 xg، 30 دقيقة ، 4 درجات مئوية) وطاف تم تطبيقه على 5 مل Hi-Trap chelating HP عمود (GE Healthcare Biosciences ، بيتسبرغ ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى جانب نظام KTA (GE Healthcare Biosciences ، بيتسبرغ ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتمت معايرته مسبقًا مع تمت تصفية البروتينات المرتبطة بتدرج غير خطي من المخزن المؤقت B (20 ملي فوسفات الصوديوم ، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 500 ملي إيميدازول ، درجة الحموضة 7.5). تم تجميع الكسور ذات نشاط β-glucosidase ، وتركيزها إلى 5 مل باستخدام وحدات الطرد المركزي Amicon Ultra وتقديمها إلى كروماتوجرافيا استبعاد الحجم باستخدام عمود Superdex 75 16/60 (GE Healthcare Biosciences ، بيتسبرغ ، الولايات المتحدة الأمريكية) تمت معايرتها مسبقًا بـ 20 ملي مولار من فوسفات الصوديوم ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5 ، بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة. تم فصل الأشكال الرباعية والمونومرية بنجاح في قمتين مختلفتين بواسطة هذه الخطوة الكروماتوجرافية وأظهرت درجة نقاء عالية وفقًا لتحليل SDS-PAGE. تم تقدير تركيز البروتين بواسطة A280 نانومتر باستخدام معامل الانقراض 110،030 م -1 سم -1.

فحوصات الإنزيم البيوكيميائية

تم قياس نشاط الإنزيم باستخدام الركيزة اللونية 4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside (صNPG ، شركة سيجما الدريش ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية). أجريت التجارب في ثلاث نسخ في تفاعلات 100 ميكرولتر في ظروف تشبع الركيزة (0.5 ملي مولار) صNPG) في محلول فوسفات الصوديوم 40 ملي درجة الحموضة 7.0. كان تركيز الإنزيم النهائي 20 نانومتر. تم تحضين التفاعلات لمدة 10 دقائق في الظروف المثلى للنشاط التحفيزي (30 درجة مئوية ودرجة الحموضة 7.0) وتوقفت مع 100 ميكرولتر من كربونات الصوديوم 1 مولار (Na2كو3).تم قياس نشاط الإنزيم بالطيف الضوئي عند 405 نانومتر لمراقبة إطلاق ص-initrophenol باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية Infinite® 200 PRO (TECAN Group Ltd. ، Männedorf ، سويسرا). تم التعبير عن القياسات على أنها نشاط نسبي (٪) مع الأخذ في الاعتبار أقصى نشاط تحفيزي لوحظ للوحدة البيولوجية للإنزيم (tetramer).

ازدواج اللون دائرية

تم استخدام التحليل الطيفي ثنائي اللون الدائري لتقييم التشكل العالمي لـ EaBglA في كل من المطابقات الرباعية والمونومرية. تم الحصول على قياسات القرص المضغوط على مطياف JASCO J-815 CD يتم التحكم فيه بواسطة نظام التحكم في درجة الحرارة CDF-426S / 15 Peltier (Jasco Analytical Instruments ، أوكلاهوما ، EUA). تم استخدام كفيت كوارتز بطول مسار 1 سم لجميع تجارب القرص المضغوط وكان كل طيف متوسط ​​ثلاثة عمليات مسح ضوئي على الأقل. كان تركيز البروتين 5.8 ميكرومتر (للرباعي والمونومر) في 20 ملي فوسفات الصوديوم ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.5. تم الحصول على جميع الأطياف عند 20 درجة مئوية في النطاق 200-260 نانومتر مع عرض نطاق 2 نانومتر وزمن استجابة 4 ثانية / نانومتر. تم طرح بيانات القرص المضغوط وتطبيعها إلى الإهليلجي المتبقي المولي مما يسمح بالمقارنة بين النماذج.

تفكك الضوء الديناميكي

نصف القطر الهيدروديناميكي (Rح) للصيغة الأحادية لـ Eaتم تحديد BglA بواسطة تشتت الضوء الديناميكي (DLS). تم تسجيل البيانات عند 20 درجة مئوية على Malvern Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments ، Worcestershire ، المملكة المتحدة) باستخدام ليزر 633 نانومتر ، في خلية كوارتز بزاوية تشتت 90 درجة. تم تحليل العينات التي تم تنقيتها من كروماتوغرافيا استبعاد الحجم بتركيزات مختلفة (0.3 إلى 1.2 مجم / مل) وتم الحصول على نصف القطر الهيدروديناميكي بعد متوسط ​​20 شوطًا من استقراء معامل الانتشار متعدية (Dt) وفقًا لستوكس- معادلة اينشتاين.

جهاز الطرد المركزي التحليلي الفائق (AUC)

أجريت تجارب سرعة الترسيب (SV) باستخدام جهاز الطرد المركزي التحليلي الفائق Beckman Optima XL-A (Beckman Coulter Inc ، Brea ، EUA). تم جمع البيانات عند 35000 دورة في الدقيقة و 20 درجة مئوية باستخدام نظام الامتصاص البصري لكل من اكتشافات 220 و 280 نانومتر. Eaتم تحضير BglA بتركيزات مختلفة (0.2 ، 0.4 و 1 مجم / مل) في 20 ملي فوسفات الصوديوم ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.4. تم تحليل فحوصات SV باستخدام طريقة c (s) في برنامج SEDFIT (الإصدار 14.4d) 36 من أجل تحديد الكتلة الجزيئية للبروتين. تم تطبيق توزيع c (s) التقليدي بمستوى ثقة تنظيم ثابت قدره 0.95 ونسبة الاحتكاك (ƒ / ƒ0) تستخدم كمعامل تنظيم. معاملات الترسيب القياسية (s20، دبليو) من خلال الحد الأقصى للقمم لمنحنيات c (S) المستمرة بعد التصحيحات لإزالة التداخلات التي تسببها اللزوجة والكثافة ودرجة الحرارة (ρ = 1.0039 جم / مل و η = 0.0102643 تم الحصول على Poise بواسطة برنامج SEDNTERP ). s °20، دبليو تم الحصول على القيمة عند التخفيف اللانهائي من خلال الانحدار الخطي لـ s20، دبليو كدالة لتركيز البروتين 37.

تشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة

تم إجراء قياسات تشتت الأشعة السينية ذات الزاوية الصغيرة (SAXS) باستخدام حزمة أشعة سينية أحادية اللون (λ = 1.488 Å) من خط الأشعة D01A-SAXS2 في مختبر ضوء السنكروترون البرازيلي (LNLS ، كامبيناس ، البرازيل). Eaتم تحضير عينات BglA في 20 ملي فوسفات الصوديوم ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.4 بتركيزات 1 و 2 مجم / مل. تم طرد العينات لمدة 30 دقيقة عند 23000 xg و 4 درجات مئوية لإزالة الركام المحتمل قبل جميع تجارب SAXS. تم ضبط مسافة العينة إلى الكاشف على 1000 مم للحصول على نطاق متجه الانتثار (q) من 0.013 إلى 0.33 Å −1 ، حيث يعني q حجم المتجه q المحدد بواسطة q = 4π sinθ / λ ( 2θ هي زاوية التشتت). تم تحليل العينات عند 20 درجة مئوية في خلايا الميكا بطول مسار 1 مم وتم تسجيل ملفات تعريف الانتثار في عشرة إطارات متتالية (مدة كل منها 10 ثوانٍ) لمراقبة الضرر الإشعاعي واستقرار الحزمة. تم طرح منحنيات SAXS التي تم الحصول عليها ودمجها باستخدام برنامج FIT2D 38. نصف قطر الدوران (Rز) من معادلة Guinier 39 وبواسطة طريقة تحويل فورييه غير المباشرة باستخدام حزمة GNOM 40. تم استخدام برنامج GNOM أيضًا لتوليد توزيع مسافة الجسيمات p (r) والقطر الأقصى ، Dالأعلى. تم تطبيق برنامج DAMMIN 41 للحصول على البداية نماذج ل EaBglA (نموذج الذرة الوهمي) ، من خلال روتين تحسين التلدين المحاكي الذي يناسب بيانات التشتت التجريبية. تمت إعادة بناء شكل البروتين بمتوسط ​​20 نوعًا مختلفًا البداية الموديلات التي تستخدم حزمة DAMAVER 42. تم فرض النموذج منخفض الدقة الذي تم الحصول عليه والهيكل البلوري باستخدام برنامج SUPCOMB 43. تم إنشاء منحنى الانتثار النظري من الإحداثيات الذرية البلورية باستخدام برنامج CRYSOL 44 ومقارنتها ببيانات التشتت التجريبية.

المسعر التفاضلي

الاستقرار الحراري لـ Eaتم فحص BglA عن طريق قياس المسعر التفاضلي (DSC). Eaتم فحص BglA ، بتركيز 2 مجم / مل في 20 ملي فوسفات الصوديوم ، و 150 ملي كلوريد الصوديوم ودرجة الحموضة 7.4 ، بمعدل 1 درجة مئوية / دقيقة في جهاز VP-DSC (Microcal ، GE Healthcare ، Northampton ، الولايات المتحدة الأمريكية) على مدى 15-90 درجة مئوية بزيادات 0.5 درجة مئوية. تم طرح ملف تعريف DSC من المخزن المؤقت ، وتطبيع التركيز ، وتم دمج ماصات الحرارة الناتجة بعد تعيين خطوط الأساس قبل وبعد الانتقال. كما تتكشف الناجم عن الحرارة Eaكان BglA لا رجوع فيه في الظروف المختبرة ، وركز التحليل على قيم درجات الحرارة الانتقالية (T.م).

تبلور البروتين

تم إجراء تجارب التبلور بواسطة طريقة انتشار البخار في 96 طبقًا جيدًا باستخدام نظام آلي لـ Honeybee 963 (Digilab ، Marlborough ، MA). Eaتبلور BglA عند 18 درجة مئوية في قطرات جلوس تحتوي على 0.5 ميكرولتر من محلول البروتين عند 15 مجم / مل و 0.5 ميكرولتر من حالة التبلور. ج2221 نمت البلورات في حالة تحتوي على 0.1 M CAPS (درجة الحموضة 10.5) ، و 0.2 M كبريتات الليثيوم و 2 M كبريتات الأمونيوم باستخدام فى الموقع تحلل البروتين (1: 1000 (ث / ث) نسبة التربسين:EaBglA). ص21 تم الحصول على بلورات في وسط يحتوي على 0.1 M TRIS (درجة الحموضة 8.5) ، 2٪ (ت / ت) كبريتات الليثيوم PEG400 و 1.45 م.

جمع البيانات وتحديد الهيكل

بيانات حيود الأشعة السينية لـ ج2221 و ص21 بلورات (محمية بالتبريد بنسبة 20٪ (ت / ت) الجلسرين) في خط إشعاع MX2 من LNLS (كامبيناس ، البرازيل) وفي خط الأشعة I03 من مصدر ضوء الماس (أوكسفوردشاير ، المملكة المتحدة) ، المجهز بكاشفات PILATUS 2M و PILATUS3 6M ، على التوالي. تمت فهرسة البيانات ودمجها وقياسها باستخدام حزمة XDS 45. تم حل التركيب البلوري بطرق الاستبدال الجزيئي باستخدام برنامج PHASER مع الإحداثيات الذرية لـ β-glucosidase من H. orenii (معرف PDB: 4PTV) كنموذج بحث. تم تنقيح الهياكل بدورات متناوبة من TLS ، صقل مزدوج (ص21 الكريستال) والتحسين المقيد (بما في ذلك قيود NCS المحلية) باستخدام REFMAC5 46 وبناء النموذج اليدوي باستخدام COOT 47. تم اختلال البقايا الأخيرة في جميع السلاسل من البلورات ولم يتم تصميمها. تم التحقق من صحة الهياكل النهائية باستخدام MOLPROBITY 48. يتم تلخيص إحصاءات جمع البيانات وصقلها في الجدول 3. عوامل الهيكل والإحداثيات الذرية لكلا الشكلين البلوريين ، P21 و C2221، في PDB تحت رموز الانضمام 5DT5 و 5DT7 ، على التوالي.

التحليلات الهيكلية

تم إجراء التراكبات الهيكلية باستخدام خدمة مقارنة بنية البروتين PDBeFold (//www.ebi.ac.uk/msd-srv/ssm). تم تحليل التفاعلات داخل الجزيئات وواجهات البروتين باستخدام خوادم PIC (//pic.mbu.iisc.ernet.in/) 50 و EPPIC (//www.eppic-web.org/ewui/) 51 ، على التوالي. تم حساب حجم تجاويف البروتين باستخدام KVFinder 52 و CASTp 53. تم تحضير الأرقام باستخدام PYMOL 54.

محاكاة الديناميات الجزيئية

تم إنشاء أنظمة المحاكاة باستخدام الحل الصريح للوحدات البيولوجية EaBglA و هوBglA (معرف PDB: 4PTX). تم إجراء محاكاة الديناميكيات الجزيئية لـ 100 نانوثانية باستخدام مجال قوة YAMBER3 مع توقيت 5 فيمتوثانية مما يوفر لقطة كل 250 بيكو ثانية باستخدام YASARA 55. تمت محاكاة كل نظام في 10 و 30 درجة مئوية باستخدام منظم الحرارة Berendsen للتحكم في درجة الحرارة. تمت مراقبة الضغط باستخدام كثافة المذيب كمسبار وتم الحفاظ عليه ثابتًا أثناء المحاكاة عن طريق تغيير حجم خلية المحاكاة بشكل متماثل لمطابقة القيم المناسبة لكثافة المذيب ، عند الحاجة.

تحليلات الديناميات الجزيئية

تم حساب متوسط ​​الجذر التربيعي للتذبذب وكذلك الروابط الهيدروجينية وجسور الملح ومنطقة المذيبات التي يمكن الوصول إليها باستخدام البرامج النصية المخصصة وإحداثيات آخر 80 نانوثانية من محاكاة 100 نانوثانية. تم تحديد روابط الهيدروجين مع الأخذ في الاعتبار طاقة الرابطة البالغة 6.25 كيلوجول / مول كعتبة ، بالنظر إلى أن طاقة الرابطة هي دالة على مسافة مستقبل الهيدروجين. تم النظر في الأزواج الكهروستاتيكية عندما كانت ذراتهم (وليس الهيدروجين) أقرب من 4 Å من بعضها البعض. تم حساب السطح الذي يمكن الوصول إليه بالمذيب باستخدام إجراءات مطبقة في برنامج YASARA.

تحليل النشوء والتطور

تم استخدام تسلسل البروتين لـ β-glucosidases من البكتيريا النفسية كطُعم في عمليات بحث BLASTp ضد قاعدة بيانات NCBI غير الزائدة عن الحاجة. تم تحديد أربع ضربات بروتين كحد أقصى بهوية تسلسلية تتراوح من 60 إلى 95٪ لكل استعلام. لأغراض المقارنة ، يتم استخدام بروتينات متجانسة من هوتم استرداد BglA أيضًا باستخدام نفس المعايير. تمت محاذاة جميع تسلسلات البروتين باستخدام برنامج MUSCLE 56. تم استبعاد المواضع التي تحتوي على فجوات أو بيانات مفقودة جزئيًا من محاذاة التسلسل المتعدد باستخدام حد تغطية الموقع بنسبة 80٪. بناءً على مجموعة البيانات الناتجة ، تم استنتاج شجرة تطورية باستخدام طريقة الاحتمالية القصوى (ML) وأفضل نموذج لاستبدال الأحماض الأمينية المشار إليه بواسطة برنامج MEGA (الإصدار 6.0) 57 ، والذي كان مصفوفة LG بافتراض أن المعدل يختلف بين المواقع وفقًا لتوزيع جاما (+ G) والسماح بوجود مواقع ثابتة (+ I). تم تقييم ثقة طوبولوجيا الشجرة باستخدام تحليل Bootstrap بناءً على 1000 تكرار من bootstrap. تم استرداد تصنيف أنواع البكتيريا من Uniprot Knowledgebase 58. تم تصنيف البكتيريا بناءً على درجة حرارة نموها المثلى ، عند توفرها ، أو في درجات الحرارة الدنيا التي تكون قادرة على النمو على أنها محبة للنفسية / نفسية التغذية (Tيختار، يقرر & lt 20 درجة مئوية تدقيقة & lt 5 ° C) ، mesophilic (20 ° C & lt T.يختار، يقرر & GT 40 درجة مئوية تدقيقة & gt 5 درجة مئوية) ومحبة للحرارة (T.يختار، يقرر & GT 40 درجة مئوية تدقيقة & GT 40 درجة مئوية) (الجدول S5).


التكيف البارد في البروتينات على المستوى التتابعي والبنيوي - علم الأحياء

لقطة بيانات تجريبية

  • الطريقة: & nbspحيود الأشعة السينية
  • القرار: نبسب2.09 Å
  • R-Value Free: & nbsp0.236 نبسب
  • R- قيمة العمل: & nbsp0.184 نبسب
  • R- القيمة المرصودة: & nbsp0.184 نبسب

التحقق من صحة wwPDBونبسب ونبسبتقرير ثلاثي الأبعاد وتقرير كامل

التعديلات الهيكلية لمركب السترات النشط على البارد من بكتيريا أنتاركتيكا.

(1998) هيكل نبسب6: 351-361

  • PubMed: & nbsp9551556 & nbsp ابحث في PubMed
  • DOI: & nbsp10.1016 / s0969-2126 (98) 00037-9
  • الاقتباس الأساسي من الهياكل ذات الصلة: & nbsp
    1 أ 59
  • ملخص PubMed: & nbsp

الأساس الهيكلي لتكييف الإنزيمات مع درجات الحرارة المنخفضة غير مفهوم بشكل جيد. تم استخدام سينثاس السترات القاتمة كإنزيم نموذجي لدراسة الأساس الهيكلي للثبات الحراري ، وقد تم تحديد بنية الإنزيم من الكائنات الحية التي تعيش في الموائل عند 55 درجة مئوية و 100 درجة مئوية سابقًا.

الأساس الهيكلي لتكييف الإنزيمات مع درجات الحرارة المنخفضة غير مفهوم بشكل جيد. تم استخدام سينسيز السترات القاتمة كإنزيم نموذجي لدراسة الأساس الهيكلي للثبات الحراري ، وقد تم تحديد بنية الإنزيم من الكائنات الحية التي تعيش في الموائل عند 55 درجة مئوية و 100 درجة مئوية سابقًا. هنا تم توسيع الدراسة لتشمل سينسيز السترات من بكتيريا أنتاركتيكا ، مما يسمح لنا باستكشاف الأساس الهيكلي للنشاط البارد والثبات الحراري عبر نطاق درجة الحرارة الكامل الذي من المعروف أن الحياة تخرج منه.


أسئلة الاستدعاء الشائعة في علم الأحياء

1.Helical / شكل حلزوني مضغوط للغاية
2- الجزيء غير قابل للذوبان لذا فهو غير نشط تناضحيًا (لا يؤثر على إمكانات الماء)
3. متفرعة بحيث يمكن الوصول إلى الجلوكوز بسهولة عن طريق الإنزيمات لتفتيت من أجل التنفس
4- جزيء كبير لا يمكنه ترك الخلية / عبر سطح الخلية
غشاء

2. انضم بواسطة التكثيف لتشكيل رابطة جليكوسيدية

4. & quot ؛ تقليب & quot من الجزيئات البديلة

5. روابط هيدروجينية تربط سلاسل طويلة مستقيمة

6. السليلوز يجعل جدران الخلايا قوية

7. يمكن أن تقاوم الضغط التورجي / الضغط الاسموزي

8. السند صعب الكسر

2. انضمت بواسطة روابط الببتيد

3. التي تتشكل عن طريق التكثيف

4. الهيكل الأساسي هو ترتيب الأحماض الأمينية

5. هيكل ثانوي قابل للطي لسلسلة البولي ببتيد بسبب الرابطة الهيدروجينية

6. الهيكل الثالث هو طي ثلاثي الأبعاد بسبب الرابطة الهيدروجينية والأيونية / ثاني كبريتيد
سندات

2. ينهار في رد فعل خطوة واحدة مما يضمن توفير الطاقة بسرعة

3. المواد الفسفورية لجعلها أكثر تفاعلاً

سكر غير مخفض
1. قم بإجراء اختبار بنديكت وظل أزرق / سلبي
2. يغلي مع حامض ثم يحيد مع القلويات
3. تسخين مع Benedict ويصبح أحمر / برتقالي (مترسب)

2. (مسبب) التغيير في تسلسل الأحماض الأمينية

3- تتراكم الطفرات بمرور الوقت

4. المزيد من الطفرات / المزيد من الاختلافات (في تسلسل الأحماض الأمينية / القاعدة / النوكليوتيدات / الأولية
هيكل) بين الأنواع ذات الصلة البعيدة
أو
قليل من الطفرات / الاختلافات (في تسلسل الأحماض الأمينية / القاعدة / النوكليوتيدات / البنية الأولية) في
الأنواع وثيقة الصلة

أيونات الصوديوم
1. النقل المشترك للجلوكوز / الأحماض الأمينية (إلى الخلايا)
2. (لأن) الصوديوم ينتقل عن طريق النقل النشط / مضخة البوتاسيوم الصوديوم
3. ينشئ تركيز أيون الصوديوم / تدرج انتشار
4. يؤثر على إمكانية التناضح / المياه

الموقع النشط مرن ويمكن أن يتشكل حول الركيزة

2. الموقع النشط مكمل فقط للمالتوز

3. وصف الاستحثاث الملاءمة

4. الإنزيم هو محفز يقلل من طاقة التنشيط المطلوبة للتفاعل

(تثبيط المنافسة)،
2. المانع له شكل مماثل للركيزة
3. يرتبط بالموقع النشط (للإنزيم)
4. يمكن التغلب على التثبيط عن طريق إضافة المزيد من الركيزة

الحفاظ على تركيز منخفض من الصوديوم في الخلية الظهارية مقارنة بـ
التجويف

ينتقل الجلوكوز إلى الخلية الظهارية بالصوديوم
عبر بروتين ناقل / قناة
ينتقل الجلوكوز إلى الدم

2. Endopeptidases كسر عديد الببتيدات إلى سلاسل أصغر الببتيد

3. يزيل Exopeptidases الأحماض الأمينية الطرفية

2. تنتج العديد من الميتوكوندريا ATP للنقل النشط
3. البروتينات الحاملة موجودة للنقل النشط

4. قناة / بروتينات حاملة لتيسير الانتشار

5. النقل المشترك للصوديوم والجلوكوز من خلال البروتين الناقل للصوديوم (أيونات) والجلوكوز

2. الفوسفوليبيد (ثنائي الطبقة) يمنع حركة / انتشار المواد القطبية / غير القابلة للذوبان في الدهون

3. البروتينات الحاملة تسمح بالنقل النشط

4. تسمح بروتينات القناة / الناقل بالانتشار / النقل المشترك

5. شكل / شحن القناة / الناقل يحدد المواد التي تتحرك

6. عدد القنوات / الحاملات يحدد مقدار الحركة

7. مساحة سطح الغشاء تحدد مقدار الانتشار / الحركة

2. جزيء طويل / كبير بحيث يمكنه تخزين الكثير من المعلومات

3. اللولب / ملفوف حتى مضغوطة

4. يسمح التسلسل الأساسي بتخزين المعلومات (تكوين البروتين)

5. تقطعت بهم السبل مزدوجة لذلك يمكن أن يحدث التكرار بشكل شبه متحفظ كما هو موجود
يمكن أن تعمل الخيوط كقوالب عبر الاقتران الأساسي التكميلي

2. قاعدة الاقتران متماسكة بواسطة روابط هيدروجينية

3. ضعف الروابط الهيدروجينية بسهولة ، مما يسمح للخيوط بالانفصال

4. قواعد مكشوفة وتعمل كقالب
5. A مع T ، C مع G

2. يكسر الروابط الهيدروجينية بين أزواج القواعد ويكشف عنها

3. خيط DNA واحد فقط يعمل كقالب

4. تنجذب نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي إلى القواعد المكشوفة

5. (الجذب) وفقًا لقاعدة الاقتران الأساسي (A-U & amp C-G)

6. ينضم بوليميراز الحمض النووي الريبي إلى نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي معًا ، لتشكيل ما قبل الرنا المرسال

3. تجلب جزيئات الحمض الريبي النووي النقال الأحماض الأمينية إلى الريبوسوم

4. يوجد جزيء tRNA محدد لحمض أميني معين

5. Anticodon من الحمض الريبي النووي النقال مكمل للكودون على مرنا

6. تتشكل روابط الببتيد بين الأحماض الأمينية المجاورة

7. الحمض الريبي النووي النقال يفصل ويترك لجمع حمض أميني آخر

2. التغيير في تسلسل الأحماض الأمينية

3. هذا يغير موضع روابط الهيدروجين / الأيونية / ثاني كبريتيد

2. كروموسومات مصنوعة من كروماتيدات متطابقة ، بسبب تكرارها في الطور البيني

3. تتحرك الكروموسومات إلى خط الاستواء للخلية

4. ترتبط الكروموسومات بألياف المغزل الفردية

5. تتقلص ألياف المغزل وتنقسم القسيمات المركزية

6. تنتقل الكروماتيدات الشقيقة إلى أقطاب متقابلة

7. يتلقى كل قطب جميع المعلومات الجينية

2. ترتبط الكروموسومات بأزواج متجانسة

3. يحدث العبور بين الكروموسومات ، من خلال تكوين التصالب

4. تنضم الكروموسومات إلى ألياف المغزل ، عبر السنتروميرات هناك

6. تتحرك الكروموسومات المتجانسة إلى أقطاب متقابلة

2. تشكيلة مستقلة (فصل الكروموسومات المتجانسة) في الانقسام الاختزالي الأول

3. تشكيلة مستقلة (فصل الكروماتيدات) في الانقسام الاختزالي الثاني

+ أي ثلاثة من:
4. يتسبب في أن يكون لدى الأفراد تكيفات مختلفة تجعل بعضها أكثر تكيفًا

7. هذه تمر على الجين / الأليل

2. الحصول على مقطع رقيق من الأنسجة النباتية ووضعها على الشريحة

3. وصمة عار مع اليود في يوديد البوتاسيوم.

2. مرشح لإزالة الحطام الكبير / الخلايا الكاملة

3. استخدم محلول متساوي التوتر لمنع تلف الميتوكوندريا / العضيات

4. حافظ على البرودة لتقليل الضرر الناجم عن الإنزيمات / استخدم المخزن المؤقت لمنع تمسخ الإنزيم

5. جهاز طرد مركزي بسرعة منخفضة لفصل النوى / شظايا الخلية / العضيات الثقيلة

2. تمر الجزيئات الصغيرة / غير القطبية / القابلة للذوبان في الدهون عبر الفوسفوليبيدات / طبقة ثنائية
أو
تمر الجزيئات الكبيرة / القطبية / القابلة للذوبان في الماء من خلال البروتينات

3. ينتقل الماء بالتناضح من إمكانات المياه العالية إلى إمكانية المياه المنخفضة

4. النقل النشط ضد التدرج التركيزي

5. النقل النشط / الانتشار الميسر يشمل البروتينات / الناقلات

6. يتطلب النقل النشط طاقة / ATP

2. لا يمكن عبور طبقة ثنائية الدهون

3. يتم نقل أيونات الكلوريد عن طريق الانتشار الميسر باستخدام
قناة / بروتين ناقل

4. الأكسجين غير مشحون / غير قطبي

2. العديد من الميتوكوندريا تنتج ATP / إطلاق أو توفر الطاقة للنشاط
المواصلات

3. البروتينات الحاملة للنقل النشط

4.بروتينات القناة / الحاملة للانتشار الميسر

5. النقل المشترك لأيونات الصوديوم والجلوكوز باستخدام بروتين سيمبورت / ناقل

2. النشط يتضمن إنتاج الجسم المضاد بواسطة خلايا البلازما / خلايا الذاكرة

3. السلبي يشمل الجسم المضاد الذي يدخل الجسم من الخارج

4. نشط على المدى الطويل ، لأن الجسم المضاد ينتج استجابة لمولد الضد

5. على المدى القصير السلبي ، لأن الجسم المضاد المعطى يتحلل

2. اجتياح العامل الممرض / ابتلاعه

3. محاطة في فجوة ، وتشكل البلعمة

4. فجوة تندمج مع الجسيم الحال

5. يحتوي الليزوزوم على إنزيمات يتم إفراغها في الفجوة

تصنع خلايا البلازما أجسامًا مضادة

2 مستضد يرتبط بالمستقبلات التكميلية على الخلايا الليمفاوية ب

يتم تنشيط 3 الخلايا الليمفاوية

تتكاثر الخلايا الليمفاوية 4 (ب) عن طريق الانقسام

2. يتم عرض المستضد على الخلايا العارضة للمستضد (الضامة)

3. ترتبط الخلية التائية المساعدة مع بروتين المستقبل التكميلي بالمستضد

4. تحفز الخلية التائية المساعدة الخلية البائية

5. مع الجسم المضاد التكميلي على سطحه

6. تفرز الخلية البائية كميات كبيرة من الجسم المضاد

3. عند التعرض الثاني تصبح خلايا الذاكرة نشطة وتنتج أجسامًا مضادة

4. إنتاج الأجسام المضادة بسرعة / إنتاج المزيد من الأجسام المضادة

2. شكل الهيكل الثلاثي لموقع الربط

3. مكمل لمولدات المضادات

يستخدم الإنزيم RNA لفيروس نقص المناعة البشرية لعمل نسخة من الحمض النووي

انضم DNA إلى DNA / كروموسوم الخلية المضيفة

يستخدم الحمض النووي لعمل نسخ من الحمض النووي الريبي لفيروس نقص المناعة البشرية

وبروتينات / إنزيمات كابسيد HIV

تجميع جزيئات الفيروس الجديدة

2. البطين لديه الآن ضغط أعلى من الأذين (بسبب الملء / الانكماش).
يؤدي هذا إلى إغلاق الصمامات الأذينية البطينية

3. البطين لديه ضغط أعلى من الأبهر مما يؤدي إلى فتح الصمام الهلالي

4. يؤدي هذا إلى ارتفاع ضغط الشريان الأورطي عن البطين (مثل القلب
يرتاح) مما يؤدي إلى إغلاق الصمام الهلالي

2. جدران سميكة أحادية الخلية - تقلل من مسافة الانتشار

3. الخلايا المسطحة (البطانية) - تقلل من مسافة الانتشار

4. Fenestrations - يسمح للجزيئات الكبيرة بالمرور

5. قطر صغير / ضيق - يعطي مساحة كبيرة للحجم / قصير
مسافة الانتشار

6. التجويف الضيق - يقلل من معدل التدفق مما يعطي مزيدًا من الوقت للانتشار

2. السائل وجزيئات الأمبير القابلة للذوبان تمر

3. البروتينات والجزيئات الكبيرة تبقى في الخلف

4. هذا يقلل من إمكانات المياه

5. يعود الماء إلى النهاية الوريدية للشعيرات الدموية
بالتناضح

2. يتم إنزال أرضية الفم

3. يدخل الماء بسبب انخفاض الضغط & أمبير
زيادة الحجم

4. يغلق الفم ويفتح الغطاء الخيشاني / الصمام الخيشومي

5. يؤدي رفع الأرضية إلى زيادة الضغط وانخفاض الحجم

الصفائح الخيشومية أو الصفائح الثانوية

عدد كبير من الشعيرات الدموية - & gt لإزالة الأكسجين / للحفاظ على التدرج

ظهارة رقيقة - & مسار انتشار قصير جي تي

تغيرات الضغط - & gt لجلب المزيد من الماء / للحفاظ على التدرج

2. رقيقة جدران الحويصلات الهوائية لتوفير مسار انتشار قصير

3. جدران الشعيرات الدموية رقيقة بين الحويصلات الهوائية مما يوفر مسار انتشار قصير

4. جدران الشعيرات الدموية / الحويصلات الهوائية لها خلايا مفلطحة

5. غشاء الخلية المنفذ للغازات

6. العديد من الشعيرات الدموية توفر مساحة كبيرة

7. العضلات الوربية وعضلات الحجاب الحاجز تستخدم لتهوية الرئتين للحفاظ على الانتشار
الانحدار

8. القصبة الهوائية الواسعة والتفرع من الشعب الهوائية / القصيبات لضمان التدفق الفعال للهواء


المواد والأساليب

جمع العينات

بارليدون sp. ، Robson 1932 ، تم جمعها خلال شهر يناير من أسفل الجليد في محطة McMurdo ، أنتاركتيكا. تم تقديم العينة التي تم جمعها من قبل الدكتور كريس ديفريس. الأخطبوط بيماكولاتوس، Verrill 1883 ، تم جمعها من قبل الغوص من Wrigley Marine Lab ، Two Harbours ، جزيرة كاتالينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. الأخطبوط defilippi، فيراني 1851 ، من ريو غراندي ، بورتوريكو. الأخطبوط digueti، Perrier و Rochebrune 1894 ، من سان لوكاس كوف ، سانتا روزاليا ، باجا كاليفورنيا سور ، المكسيك. باثيبوليبوس أركتيكوس (بروش 1847) و Benthoctopus piscatorum (Verrill 1879) قبالة الساحل الشمالي لأرخبيل سفالبارد ، النرويج. من جميع العينات ، تم تشريح العقد النجمية ، وحفظها لاحقًا في الحمض النووي الريبي (أمبيون ، أوستن ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تجميدها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية.

الاستنساخ الجزيئي

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من كل عقدة نجمية باستخدام مجموعة RNAqueous-Micro (Ambion) واستخدمت كقالب لتخليق (كدنا) مع مجموعة تركيب (كدنا) أول حبلا SuperScript III (Invitrogen ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تضخيم الوحدات الفرعية Na + / K + -ATPase كاملة الطول بواسطة PCR باستخدام بوليميريز Taq (لـ O. bimaculatus و بارليدون sp.) أو الانصهار بوليميراز (O. defilippi ، O. digueti ، B. arcticus و B. piscatorum) والبادئات المستندة إلى UTRs لملف Loligo opalescens Na + / K + -ATPase استنساخ الوحدة الفرعية α [GenBank: EF467998 (Colina et al. ، 2007)]. للحصول على تسلسل إجماع ، تم تسلسل العديد من الحيوانات المستنسخة (كدنا) حتى الاكتمال.

التعبير الوظيفي في Xenopus البويضات

تم استنساخ منطقة الترميز للوحدة الفرعية Na + / K + -ATPase α لكل نوع في Xenopus ناقل التعبير pBSTA (Liman et al. ، 1992) ويستخدم كقالب لتخليق cRNA مع مجموعات قائمة على المروج T7 (نظام إنتاج mMessage mMachine T7 Ultra أو Ambion أو mRNA mRNA ، Epicenter ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تصنيع الحمض النووي الريبي أيضًا للوحدة الفرعية الأم لنظام محوار الحبار العملاق [GenBank: EF467996 (Colina et al. ، 2007)]. تم حقن البويضات بـ 80 نانوغرام من مزيج متساوي المولي من وحدات الحمض النووي الريبي الوراثي ألفا وبيتا. أجريت التجارب بعد 3-4 أيام من الحقن. تمت إزالة البويضات جراحيًا وإزالة الجريبات عن طريق العلاج الأنزيمي بالكولاجيناز. تم اختيار البويضات من المرحلة الخامسة والسادسة للحقن. بعد الحقن ، تم الحفاظ على البويضات لمدة 3-4 أيام عند 18 درجة مئوية في محلول ND-96 (مليمول لتر -1: 96 كلوريد الصوديوم ، 2 KCl ، 1.8 CaCl2، 1 مغكل2 و 5 Hepes pH 7.6). مباشرة قبل التسجيل ، تم تحميل البويضات بـ Na لمدة 45 دقيقة في محلول تحميل Na (في مليمول لتر -1: 100 Na-glutamate و 2.5 Na-citrate و 5 Hepes pH 7.5) (Rakowski et al. ، 1991 ).

الحلول التجريبية للقياسات الكهربية

كانت المحاليل خارج الخلوية المستخدمة لتقييم وظيفة المضخة خلال هذه الدراسة عبارة عن محلول 5 مليمول لتر -1 ك + (في مليمول لتر -1: 100 Na-glutamate ، 5 K-glutamate ، 5 BaCl2، 2 نيكل2، 5 Hepes، 2 MgCl2 و 0.3 حمض نيفلوميك) ومحلول خالٍ من البوتاسيوم (مثل محلول 5 مليمول لتر -1 ك + باستثناء 5 مليمول لتر -1 ن-ميثيل د-جلوكامين تم استبداله بـ 5 مليمول لتر -1 K +). تم استخدام Ouabain بتركيز 100 ميكرولتر لتر -1 في كل من المحاليل الخالية من 5 مليمول لتر -1 K أو K +. عند استخدام تقنية "فجوة الفازلين البويضة المفتوحة" (انظر أدناه) ، احتوى المحلول الداخلي (مليمول لتر -1): 80 غلوتامات الصوديوم ، 20 شاي-غلوتامات ، 10 MgSO4، 10 Hepes ، 5 EGTA و 5 MgATP. للحصول على وصول كهربائي إلى الداخل ، تم نفاذ البويضات باستخدام 0.2 ٪ (وزن / حجم) سابونين في المحلول الداخلي. تم تعديل الرقم الهيدروجيني لجميع المحاليل التجريبية إلى 7.5 مع ن-ميثيل د-جلوكامين عند درجة حرارة الغرفة وتم تحديده على أنه يختلف بمقدار 0.2 وحدة بين 30 و 5 درجات مئوية.

Na + / K + -ATPase مستويات التعبير

تم تقييم مستويات التعبير على أنها إجمالي تيار حساس ouabain مسجل من البويضات الكاملة التي تعبر عن أي بناء. تم تثبيت البويضات باستخدام مضخم الجهد التقليدي ثنائي القطب (GeneClamp 500B Axon Instruments ، Foster City ، CA ، USA). تم ترشيح الإشارات التناظرية عند 1 كيلو هرتز وتم رقمنتها باستخدام محول التكامل المبتكر SBC6711 A / D (Simi Valley ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم توفير برنامج GPATCH من قبل الدكتور فرانسيسكو بيزانيلا. تم الاحتفاظ بالبويضات عند 0 مللي فولت ، وتم تنشيط المضخات بالكامل باستخدام محلول 5 مليمول لتر -1 K + ، متبوعًا بإضافة ouabain. تم تسجيل تعبير المضخة الذاتية من البويضات غير المحقونة. أجريت جميع التجارب لتقييم مستوى التعبير عند درجة حرارة الغرفة (-22 درجة مئوية).

الاعتماد على الجهد ودراسات معدل الدوران

تم إجراء تجارب الاعتماد على الجهد ومعدل الدوران باستخدام تقنية "فجوة الفازلين البويضة المفتوحة" (Taglialatela et al. ، 1992). تم تثبيت البويضات باستخدام مشبك البويضات عالي الأداء Dagan CA-1B (Dagan Corporation ، Minneapolis ، MN ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وأخذ عينات حصريًا من قطب الحيوان لتقليل الإشارة من المضخات الداخلية (Holmgren and Rakowski ، 1994). في هذه التجارب ، تم الاحتفاظ بالبويضات عند 0 مللي فولت وتدخلت إلى إمكانات مختلفة تتراوح من -200 إلى +50 مللي فولت بزيادات قدرها 10 مللي فولت. كان طول النبضات إما 35 أو 60 مللي ثانية. تم استخدام لوحة A / D للتكامل المبتكر SBC6711 مع برنامج GPATCH للتحكم في بروتوكولات الجهد ورقمنة الإشارات التناظرية. تم جمع السجلات على قاعدة زمنية بطيئة ("سجلات الرسم البياني") باستخدام لوحة MiniDigi 1A وبرنامج AxoScope 9.0 (Axon Instruments). تم الحصول على الإشارات عند 100 كيلو هرتز وترشيحها عند 10 كيلو هرتز. تم قياس الجهد داخل الخلايا باستخدام ماصة 0.2–0.3 MΩ مملوءة ب 1 مول لتر -1 كلوريد الصوديوم ، والجسور مملوءة بـ 3 مول لتر -1 Na-MES (4-مورفولين إيثان سلفونيك ملح صوديوم) في 3٪ (وزن / حجم) الاغاروز. في جميع التجارب ، تم تقييم ثبات التسجيلات بواسطة ضوابط الوقت ، التي تم الحصول عليها من الفرق بين التيار والجهد (أناالخامس) العلاقات التي تم الحصول عليها في ظل نفس الظروف التجريبية في فترات زمنية مكافئة. أجريت هذه التجارب عند -22 درجة مئوية.

تم تقييم اعتماد الجهد على تيار Na + / K + -ATPase عن طريق تنفيذ بروتوكول الجهد في حلول 5 مليمول لتر -1 ك + قبل وبعد إضافة 100 ميكرولتر لتر -1 ouabain. نتج عن الفرق بين هذه التسجيلات تيار المضخة الحساس لأوبين. تم قياس ورسم تيار الحالة المستقرة الناتج عند كل جهد. تم قياس احتمالية حدوث تيار نصف الحد الأقصى (متوسط ​​النقطة المتوسطة ± sem) لكل بنية Na + / K + -ATPase من أناالخامس مؤامرة لكل تجربة ثم متوسطها. تم اختبار أهمية قيم النقطة الوسطى باستخدام اثنين من السكان ر-اختبار مع α = 0.05.

حساسية درجة الحرارة لمعدل دوران Na + / K + -ATPase

تمت دراسة حساسية درجة الحرارة للمضخات في البويضات الكاملة باستخدام مشبك جهد كهربائي مزدوج. تم الاحتفاظ بالبويضات عند 0 مللي فولت في غرفة حيث تم التحكم في درجة الحرارة باستخدام أجهزة بلتيير. تم تنشيط المضخات بـ 5 مليمول لتر -1 K + عند 30 درجة مئوية. بمجرد التفعيل الكامل ، تنخفض درجة الحرارة تدريجياً إلى -5 درجة مئوية ثم تعود إلى 30 درجة مئوية. ثم تكرر هذا البروتوكول بحضور عبين لتقييم التيارات المتسربة. أثناء التسجيلات الحالية ، تم تسجيل درجة الحرارة في وقت واحد عن طريق وضع مزدوج حراري بجوار البويضة مباشرة. تمت معايرة ناتج المزدوج الحراري وجمعه عند 1 كيلو هرتز عبر الإنترنت. كان التسرب المعتمد على درجة الحرارة ضئيلًا مقارنة بتيار المضخة. لكل تجربة ، تمت تسوية كمية تيار حساس ouabain عند كل درجة حرارة إلى القيمة عند 22 درجة مئوية. ثم تم حساب متوسط ​​القيم الطبيعية التي تم الحصول عليها من التجارب الفردية لبويضات متعددة. تم عمل تقديرات لمقدار تيار المضخة الداخلي عند كل درجة حرارة باستخدام مقدار التيار الداخلي في البويضات غير المحقونة عند 22 درجة مئوية وحساسية درجة الحرارة للتيار الداخلي (انظر المادة التكميلية الشكل S1). ثم تم طرح القيم الذاتية من البيانات الخاصة بالبويضات المستنسخة المحقونة. تم تحويل هذه القيم (تعني ± sem) إلى معدلات دوران بناءً على معدلات الدوران المحددة عند 22 درجة مئوية. في بعض الحالات تم تطبيع البيانات إلى القيمة الحالية عند 28 درجة مئوية.


الشكل S1. ΔB'- قيم سيرين بروتياز سيرين (PDB:

ملف إضافي 1: 1ELT) وسيرين بروتياز ميسوفيليك (PDB:1EAI) في كل موضع حمض أميني في محاذاة زوجية. رسم بياني لقيم B من البروتين المقترن 1ELT و 1EAI. في الجزء العلوي يوجد الهيكل الثانوي للإنزيم المضاد للبكتيريا. يتم الحصول على منطقة صلبة مرئية من (الأحماض الأمينية 1-110) ومنطقة مرنة واحدة (الأحماض الأمينية 111-235) باستخدام منهجية القيمة B. الشكل S2. جدول عدد المواقف الموجودة في كل هيكل ثانوي في الزوج النفسي / الوسطي. جدول عدد المواقف الموجودة في كل هيكل ثانوي في 20 زوجًا نفسيًا / متوسطيًا. الشكل S3. رسم بياني للمياه البلورية المدفونة لكل زوج نفسي / متوسط. قطعة من المياه البلورية المدفونة من 20 زوجًا نفسيًا / متوسطيًا. في الحالات التي توجد فيها سلاسل متعددة في التركيب البلوري ، تم حساب متوسط ​​القيم. ملاحظة: لا يحتوي 1a59 على مياه بلورية تم الإبلاغ عنها. (ملف PDF بحجم 1 ميجابايت)


شاهد الفيديو: الحلو-بيولوجيا-تصنيف البروتينات (قد 2022).