معلومة

1.12: تقييد الهضم باستخدام الهلام الكهربائي - علم الأحياء

1.12: تقييد الهضم باستخدام الهلام الكهربائي - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أهداف التعلم

الأهداف:

  • افهم وظيفة إنزيمات التقييد.
  • إجراء تحليل لشظايا الحمض النووي بالهلام الكهربائي.

نتائج تعلم الطلاب:

عند الانتهاء من هذا المعمل ، سيتمكن الطلاب من:

  • اقرأ خريطة البلازميد لتحديد مواقع التقييد وأحجام الأجزاء.
  • تحديد ما إذا كانت تسلسلات التعرف على إنزيم التقييد هي متجانسة.
  • توقع أحجام شظايا الحمض النووي المتكونة بعد هضم التقييد.
  • قارن نطاقات الرحلان الكهربائي للهلام لتحديد أحجام الحمض النووي.

مقدمة

تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف ممكنة بسبب العديد من الأدوات المفيدة لمعالجة جزيئات الحمض النووي وتحويل الخلايا - بما في ذلك البلازميدات ، والإنزيمات المقيدة و DNA ligase. يقدم لك هذا المعمل تعريفًا بالبلازميدات والإنزيمات المقيدة ، بالإضافة إلى التقنية المعملية للرحلان الكهربائي للهلام. ستعرفك التجارب المعملية اللاحقة على أدوات التكنولوجيا الحيوية الأخرى.

أنزيمات التقييد (وتسمى أيضا نوكليازات تقييد) عبارة عن بروتينات تصنعها العديد من الأنواع البكتيرية ، للدفاع ضد الالتهابات الفيروسية. يتحرك كل إنزيم تقييد على طول جزيء الحمض النووي حتى يجد محددًا تسلسل التعرف في الحمض النووي. يقطع الإنزيم الحمض النووي مزدوج الشريطة ، مما يؤدي إلى شظايا الحمض النووي. تم اكتشاف أكثر من 3000 إنزيم تقييد يتعرف على متواليات متناظرة قصيرة (4-8 بي بي).

يوضح الشكل 1 تسلسل التعرف على إنزيم التقييد Hind III. لاحظ أن تسلسل التعرف هو ملف متناظرة، ويقرأ نفس الانتقال للأمام وللخلف. يصنع إنزيم Hind III مذهول يقطع الحمض النووي ، وينتج شظايا لها مناطق مفردة تقطعت بها السبل تسمى "النهايات اللاصقة". يوضح الشكل 2 تسلسل التعرف على اثنين من إنزيمات التقييد الأخرى Sca 1 و Pst 1. يقوم الإنزيم Pst 1 بعمل قطع متقطع من الحمض النووي عند تسلسل التعرف عليه. لكن إنزيم التقييد Sca I يجعل a حاد قطع في تسلسل التعرف الخاص به لتوليد أجزاء من الحمض النووي بدون نهايات لزجة.

تحتوي الخلايا البكتيرية على جميع جيناتها (الجينوم) في كروموسوم دائري واحد. لكن الخلايا البكتيرية يمكن أن تحمل أيضًا قطعًا غير أساسية من الحمض النووي تسمى البلازميدات. البلازميد عبارة عن دنا دائري صغير قادر على تكرار نفسه ، ويمكن أن يحمل بعض الجينات من خلية إلى أخرى. العلماء قادرون على تصميم البلازميدات المؤتلفة لنقل جينات معينة إلى الخلية المضيفة المستهدفة.

الخريطة الجينية للبلازميد "pUC19" موضحة في الشكل 3. الحجم الكلي للبلازميد هو 2686 زوج قاعدي. يوجد موقع التعرف على Pst I في الموضع 439 ، موقع التعرف Hind III في الموضع 447 ، وموقع التعرف Sca I في 2179. إذا تم استخدام إنزيم تقييد واحد لقطع بلازميد pUC19 ، فما الذي سيتم إنتاجه؟

حدد أجزاء الحمض النووي التي يتم إنتاجها عند استخدام إنزيمين مقيدين لقطع الحمض النووي للبلازميد pUC19.

الجدول 1. شظايا الحمض النووي المتوقعة من الهضم المقيد لبلازميد pUC19

قطع باستخدام إنزيمات تقييد

Sca I و Pst I

Sca I و Hind III

Pst I و Hind III

أحجام أجزاء الحمض النووي الناتجة

الجزء الأول: تقييد الهضم

أجار هو عديد السكاريد مشتق من الطحالب الحمراء. يذوب مسحوق الأجار أولاً في سائل مغلي ، ثم يبرد ليشكل مادة صلبة هلامية. نظرًا لأن الميكروبات لا تستطيع هضم الأجار ، تُستخدم هذه المادة بشكل شائع في المختبرات للاحتفاظ بالمغذيات التي تحتاجها البكتيريا.

المواد

  • الماصة الدقيقة P-20
  • صندوق من أطراف الماصة التي تستخدم لمرة واحدة
  • تنظيف الأنابيب الدقيقة
  • رف أنبوب Microfuge
  • علامة دائمة
  • حاوية نفايات للأطراف المستخدمة وأنابيب microfuge
  • أنابيب ميكروفوج تحتوي على:
  • DNA البلازميد pUC19
  • DNA البلازميد pPUS2
  • إنزيم تقييد Pst 1
  • إنزيم التقييد Sca 1
  • العازلة التقييد
  • الماء منزوع الأيونات

ادوات

  • جهاز الطرد المركزي
  • 37احمام مائي ج (أو حمام جاف أو حاضنة)

طريقة

  1. استخدم Sharpie لتسمية الجزء العلوي والجانب من 3 أنابيب ميكروفوج نظيفة A B C واسم مجموعتك.
  2. اتبع جدول الكاشف أدناه واستغني عن الكميات المناسبة من الكواشف للأنابيب المسمى. استخدم نصائح جديدة للكواشف المختلفة. أضف الكواشف إلى المحلول الموجود أسفل الأنبوب. تأكد دائمًا من أن طرف الماصة فارغ بعد صرف الكاشف.

style = "border: 1 بكسل أسود خالص ؛"

الجدول 2. أحجام الكواشف المراد إضافتها إلى كل أنبوب

الة النفخ

الحمض النووي

Pst 1 RE

Sca 1 RE

العازلة التقييد

ماء

أ

4 ميكرولتر pPUS2

2 ماي

لا أحد

4 ماي

لا أحد

ب

4 ميكرولتر pUC19

2 ماي

2 ماي

2 ماي

لا أحد

ج

4 ميكرولتر pUC19

2 ماي

لا أحد

4 ماي

لا أحد

د

4 ميكرولتر pUC19

لا أحدلا أحدلا أحد

6 ماي

  1. غطاء الأنابيب بإحكام ضع أنبوبين مباشرة عبر بعضهما البعض في جهاز الطرد المركزي الصغير.
  2. تدور لمدة خمس ثوان لإحضار جميع الكواشف إلى أسفل كل أنبوب.
  3. ضع الأنابيب في رف عائم في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل (ولكن ليس أكثر من ساعتين).
  4. بعد انتهاء فترة الحضانة ، ستقوم بتحليل المحتويات عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام في الجزء الرابع.

الجزء الثاني: صب جل الاغاروز

الاغاروز عبارة عن كربوهيدرات معقد توجد في الأعشاب البحرية. إذا تم إذابة الاغاروز في سائل مغلي ثم تم تبريده ، يتحول المحلول إلى مادة هلامية صلبة. سيتم سكب محلول الاغاروز في صينية الصب لتشكيل شكل الهلام المطلوب. مشط الهلام له أسنان تُستخدم لتشكيل "الآبار" أو الثقوب لتحميل العينات. سوف تستعد وتلقي 1٪ من هلام الاغاروز مع محلول الرحلان الكهربي.

المواد

  • مسحوق الاغاروز
  • وزن القارب
  • الملعقة المسطحة
  • شريط الإخفاء
  • 100 اسطوانة متدرجة
  • دورق مخروطي سعة 250 مل
  • علبة الصب هلام الكهربائي
  • مشط جل
  • ماء منزوع الأيونات أو ماء مقطر
  • 1X الكهربائي العازلة
  • قفازات أو ملقط سيليكون مقاوم للحرارة
  • ميزان إلكتروني أو تحليلي
  • الميكروويف

طريقة

ملحوظة

  • ملحوظة: إذا كان لديك مخزون مؤقت للرحلان الكهربي ، فيجب عليك تخفيف المخزون إلى تركيز عامل 1X قبل تحضير محاليل agarose أو تشغيل الرحلان الكهربي للهلام.
  • بالنسبة لمخزون 20 مرة ، قم بخلط 25 مل من مرقة 20X مع 475 مل من الماء منزوع الأيونات لعمل 500 مل 1X عازلة.
  • لمخزون 50 مرة ، اخلطي 10 مل 50X مع 490 مل من الماء منزوع الأيونات لعمل 500 مل 1X عازلة.
  1. باستخدام الاسطوانة المتدرجة ، قم بقياس 100 مل من المخزن المؤقت 1X الكهربائي.
  2. باستخدام مقياس إلكتروني ، قم بقياس 1.0 جرام من مسحوق الاغاروز.
  3. صب بعض من المخزن المؤقت المقاس في دورق مخروطي سعة 250 مل. صب مسحوق الاغاروز المقاس. صب بعض من العازلة المقاسة في قارب الوزن agarose ، وصب في القارورة. كرر حتى يتم نقل كل الاغاروز إلى القارورة. صب بقية العازلة في القارورة.
  4. قم بتغطية فتحة القارورة بغلاف بلاستيكي. استخدم طرف ماصة لعمل ثقب صغير في الغلاف البلاستيكي.
  5. ضع القارورة المغطاة في الميكروويف وسخنها على نار عالية. عندما ترى فقاعات تتشكل في المحلول ، أوقف الميكروويف مؤقتًا واستخدم قفازات الفرن لتحريك القارورة برفق عدة مرات.
  6. استمر في طهي القارورة في الميكروويف حتى يبدأ السائل في الظهور مرة أخرى. باستخدام قفازات الفرن ، أمسك القارورة بالضوء وقم بتدوير المحلول. انظر بعناية للتأكد من عدم وجود بقع أو دوامات من الاغاروز معلقة في السائل. إذا كان السائل صافياً ، يذوب الاغاروز. انتظر خمس دقائق حتى يبرد [اغروس). ملاحظة: سيعلم المدرب ما إذا كان لديك نظام حامل صب ولست بحاجة إلى لصق كل درج.
  7. قم بإعداد صواني هلام الرحلان الكهربائي الاكريليك للصب. قد تحتاج إلى لصق الطرفين المفتوحين لكل صينية. تأكد من الضغط على الشريط بإحكام على طول حافة الدرج بالكامل بأظافرك. إذا كنت تستخدم شريطًا لاصقًا ، يمكنك رؤية اختلاف في شفافية الشريط.
  1. ضع مشطًا في كل صينية قبل إضافة محلول الاغاروز.
  2. عندما يبرد محلول الاغاروز لدرجة أنه يمكنك لمس الجزء السفلي من القارورة بأمان (حوالي 60 درجة مئوية ؛ حوالي خمس دقائق) ، صب محلول الاغاروز في كل صينية صب ، بحيث يغطي المحلول حوالي 2 مم من كل مشط. ملاحظة: يتطلب كل جل Mini One 12.5 مل من محلول agarose ، كل صينية صب تحتوي على جلين = 25 مل إجمالاً.
  3. بمجرد أن تصلب المواد الهلامية (والتي ستستغرق حوالي 30 دقيقة) ، اسحب المشط من كل هلام. اسحبه للخارج مباشرة دون هزه ذهابًا وإيابًا ؛ سيؤدي ذلك إلى تقليل الأضرار التي لحقت بالجدار الأمامي للبئر.

الجزء الثالث: ممارسة سحب العينات

أثناء انتظار احتضان ملخص التقييد ، يمكنك التدرب على تحميل العينات في مادة هلامية. نظرًا لأنه من السهل جدًا ثقب المواد الهلامية من مادة الاغاروز ، فمن المهم أن يكون لديك تقنية جيدة لتحميل العينات. نظرًا لأن آبار الهلام صغيرة ، ادفع الماصة الدقيقة فقط إلى المحطة الأولى لتوزيع العينة. يشبه الحمض النووي المنقى الماء ، لذلك تتم إضافة صبغة ملونة للتأكد من أنه يمكنك رؤية العينة وهي تحمل في البئر. يضاف الجلسرين ، وهو سائل لزج ، إلى صبغة التحميل للتأكد من أن عينة الحمض النووي ستغرق في قاع البئر.

المواد

  • الماصة الدقيقة P-20
  • صندوق من أطراف الماصة التي تستخدم لمرة واحدة
  • حاوية نفايات للنصائح المستخدمة
  • أنبوب صبغ ملون / جلسرين
  • الاغاروز أو هلام ممارسة البولي يوريثين
  • مسحوق الاغاروز
  • وزن القارب
  • الملعقة المسطحة
  • شريط الإخفاء

طريقة

  1. شاهد الفيديو أو العرض التوضيحي للمدرب.
  2. اغمر جل التدريب بالماء أو المحلول المنظم.
  3. تدرب على تحميل 5 ميكرولتر و 10 ميكرولتر من الصبغة الملونة في عدة آبار من هلام التدريب. لا تغير النصائح لهذه الممارسة.
  4. لتثبيت يد الماصة ، ضع مرفقك على المنضدة. يمكنك أيضًا استخدام يدك الأخرى لدعم وتثبيت يدك الماصة.

الجزء الرابع: الرحلان الكهربائي الهلامي

الرحلان الكهربائي للهلام هو تقنية لاستخدام التيار الكهربائي لفصل خليط من الجزيئات مثل الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والبروتينات. يحتوي العازل الكهربائي على أيونات لتوصيل التيار الكهربائي. نظرًا لأن جزيئات الحمض النووي مشحونة سلبًا ، فإنها تهاجر نحو القطب الموجب (الأحمر). سيكون لمصفوفة هلام الاغاروز المتصلبة مسام بأحجام مختلفة (على غرار الإسفنج) ، وبالتالي فإن حجم الجزيئات وشكلها وشحنها يمكن أن يؤثر على معدل السفر عبر هلام الاغاروز. الجزيئات الأصغر تتحرك أسرع من الجزيئات الأكبر.

يمكن تصور الحمض النووي بأصباغ مختلفة. يستخدم العلماء عادةً بروميد الإيثيديوم (إما داخل هلام الاغاروز أو بعد صبغه بعد تشغيل الجل). نظرًا لأن بروميد الإيثيديوم مطفر ، فلن نستخدمه في صفنا. بدلاً من ذلك ، سنستخدم صبغة الجل الخضراء ، والتي تتوافق مع أجهزة ترانسيلوميتور LED الزرقاء (على سبيل المثال. MiniOne). الصبغة البديلة هي الجل الأحمر ، والتي تعمل مع أجهزة ترانسلومينيتور للأشعة فوق البنفسجية.

المواد

  • مسحوق الاغاروز
  • وزن القارب
  • الملعقة المسطحة
  • شريط الإخفاء
  • 100 اسطوانة متدرجة
  • دورق مخروطي سعة 250 مل
  • علبة الصب هلام الكهربائي
  • مشط جل
  • ماء منزوع الأيونات أو ماء مقطر
  • 1X الكهربائي العازلة
  • قفازات أو ملقط سيليكون مقاوم للحرارة
  • ميزان إلكتروني أو تحليلي
  • الميكروويف

طريقة

إعداد عينات الحمض النووي

  1. ابحث عن الأنابيب الخاصة بك من ملخص التقييد (الجزء 1).
  2. أضف 2 ميكرولتر من صبغة الجل الخضراء في كل أنبوب من أنابيب العينة. الماصة لأعلى ولأسفل مرتين لخلط السائل.
  3. ضع الأنابيب في تكوين متوازن في MicroCentrifuge ودور لمدة خمس ثوان.

إعداد نظام التفريد الكهربائي

  1. شاهد عرضًا توضيحيًا أو مقاطع فيديو مخصصة واتبع التعليمات الخاصة بوضع علبة الهلام في خزان العزل الكهربائي.
  2. املأ الخزان العازل بـ 1X Electrophoresis المؤقت ، مع التأكد من أن الجل بالكامل مغمور بالكامل. أنت تريد طبقة سائلة تبلغ حوالي 1 مم فوق الجل ، لكن لا تحتاج إلى الكثير من العازلة لأن ذلك يمكن أن يبني المقاومة.
  3. تأكد من أن الهلام موجه مع عينات الآبار الأقرب إلى القطب السالب (أسود). تأكد من أن سلك الطاقة يمكن أن يصل بسهولة. تأكد من أن علبة الجل لن تحتاج إلى تحريكها لمدة 30 دقيقة.
  4. ارسم وسجل في دفتر ملاحظاتك كيف سيتم تحميل العينات في الجل. تحقق مما إذا كنت ستشارك الجل مع مجموعة أخرى.
  5. باستخدام طرف جديد لكل عينة ، قم بتحميل عينات الحمض النووي بعناية في آبار الهلام.
  6. بعد تحميل جميع العينات ، ضع الغطاء فوق صندوق الرحلان الكهربائي. [ملاحظة: الجل الأخضر حساس للضوء بشكل خاص ، لذلك لا تترك ضوء Mini One مضاءً أثناء الرحلان الكهربائي].
  7. قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية بمصدر الطاقة. قم بتوصيل كلا الخيوط بنفس القناة ، مع الكاثود السالب (-) بالكاثود (الأسود إلى الأسود) والأنود الموجب (+) بالقطب الموجب (الأحمر إلى الأحمر). [ملاحظة: يجب أن يحتوي نظام Mini One على غطاء محرك برتقالي اللون ليتم تشغيله].
  8. قم بتشغيل مصدر الطاقة واضبط الجهد على 130-135 فولت. [ملاحظة: لا تحتوي أنظمة Mini One على جهد قابل للتعديل].
  9. بعد تشغيل الطاقة على علب الهلام ، ابحث عن فقاعات تتشكل على القطب السالب (لإظهار التيار الكهربائي) وأن الأصباغ تتحرك في الاتجاه الصحيح. في حالة التشغيل بطريقة خاطئة ، انتظر حتى تصبح الصبغات داخل هلام الاغاروز ، ثم اقلب الجل 180 درجة وأعد التشغيل ..
  10. لا تسمح لصبغة التحميل بالتسرب من الجل. تأكد من إيقاف تشغيل مفتاح الطاقة وفصل الأقطاب الكهربائية عن مصدر الطاقة. افعل ذلك عن طريق إمساك القطب الكهربي في القابس البلاستيكي وليس السلك.
  11. قم بإزالة الغطاء بعناية من علبة الجل والتقط علبة الجل. ضع الجل على غلاف بلاستيكي فوق جهاز الإنارة المناسب. التقاط صورة.
  12. قارن أحجام سلم الحمض النووي بأجزاء pUC19. تحتوي قطع pPSU1 باستخدام Pst1 على أجزاء من 4100 و 2000 و 1000 و 900 و 800 و 700 و 500. قطع pPSU2 باستخدام Pst I لها أحجام 4100 و 1500 و 600 و 500 و 400 و 300 و 200 و 100 و 50.
  13. ما هي أحجام شظايا الحمض النووي لـ pUC19؟

النتائج

أسئلة الدراسة

  1. في الطبيعة ، ما هي وظيفة إنزيمات التقييد؟
  2. ما هو المتناظرة؟ كيف يرتبط ذلك بتقييد الإنزيمات؟
  3. لماذا تحتوي مختبرات أبحاث البيولوجيا الجزيئية دائمًا على أفران ميكروويف؟
  4. لماذا لا تأكل في مختبر أبحاث البيولوجيا الجزيئية؟
  5. كيف توزع العينات في هلام الاغاروز؟

هضم التقييد التشخيصي

إنزيمات التقييد هي نوكلياز داخلية بكتيرية تحدث بشكل طبيعي وتتعرف على مجموعة كبيرة من تسلسلات الحمض النووي. نظرًا لتنوع هذه الإنزيمات والمواقع الفريدة التي يتعرفون عليها ، أصبحت عملية الهضم المقيدة هي الطريقة الأكثر استخدامًا التي يستخدمها العلماء لنقل قطعة معينة من الحمض النووي بشكل انتقائي من بلازميد إلى آخر. يستفيد هضم إنزيم التقييد التشخيصي من حقيقة أن إنزيمات التقييد تشق الحمض النووي في تسلسلات محددة تسمى مواقع التقييد. غالبًا ما يكون حجم إدراج البلازميد والعمود الفقري المتجه معروفين ، وبالتالي يمكن استخدام هذه التقنية بسرعة للتحقق من البلازميد الخاص بك.

الهدف من الملخص التشخيصي هو تقطيع البلازميد إلى قطع ذات أحجام محددة وتحليل الأجزاء الناتجة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. يمكن أن يشير نمط الأجزاء الموجودة على الجل إلى ما إذا كان البلازميد يحتوي على الحجم المتوقع. عن طريق اختيار الإنزيم (الإنزيمات) المناسبة ، يمكن للمرء إما أن يخطي البلازميد لتحديد حجم البناء بأكمله أو إزالة بعض أو كل إدراج منه.

قبل البدء في هضم التشخيص ، ستحتاج إلى اختيار إنزيم مقيد أو إنزيمات تقطع البلازميد. تسمح لك العديد من أدوات تحليل الحمض النووي ، بما في ذلك محلل تسلسل Addgene ، بتحديد مواقع التقييد الموجودة في تسلسل معين. للحصول على قائمة بإنزيمات التقييد المتاحة تجاريًا والمستخدمة بشكل شائع ، راجع موقع New England Biolabs.

آخر تحميل: 18 مايو 2018

شاهد فيديو البروتوكول أدناه للتعرف على كيفية تحليل ملخص القيود.

  • قسمة الحمض النووي السائل للبلازميد الذي يهمك (انظر أدناه لمعرفة الكميات الموصى بها)
  • إنزيم التقييد المناسب (انظر تعليمات الشركة المصنعة للكمية المناسبة)
  • المخزن المؤقت لملخص التقييد المناسب (انظر تعليمات الشركة المصنعة)
  • صبغ جل التحميل
  • العازلة الكهربائي

3 إجابات 3

ليس لدي يد في ذلك ، لكنني لن أتفاجأ إذا هاجر الحمض النووي فائق الالتفاف على مسافات مختلفة وفقًا للبعض التشكل الطوبولوجي الداخلي (على سبيل المثال ، ملفوف أكثر أو أقل و / أو أكثر أو أقل تقشرًا). وبالمثل ، تبرز هذه الصورة> 8 مطابقة. ما يتم تشغيله في الجل هو دنا ملتهمة دائرية مع درجة معينة من العقد بسبب التعميم (الحمض النووي للعاثية يكون خطيًا بخلاف ذلك).

الشكل من: Arsuaga et al. 2005 ، PNAS 102 (26) 9165-9169 (مجانًا على PubMed Central)

احتمال نظري آخر هو أن اثنين أو أكثر من البلازميدات ذات الأحجام المختلفة نمت في نفس maxiprep بسبب بعض التلوث. لكن في هذه الحالة ، ستكتشف المشكلة أيضًا في الهضم ، لذلك لا يبدو أن هذا هو حالتك.

جيان باولو محق في أنك ترى التشكيلات المختلفة للحمض النووي الدائري.

ينتج عن نمو البلازميدات في البكتيريا ثلاثة أشكال رئيسية: مرتخية وملفوفة وملفوفة للغاية.

  • يميل الاسترخاء إلى الركض أعلى قليلاً من الحجم المتوقع لأنه لا يمكنه السفر بكفاءة عبر agarase
  • ينتقل الملفوف إلى مسافة أبعد قليلاً من الحجم المتوقع لأنه أكثر إحكاما قليلاً وبالتالي يهاجر بسهولة أكبر
  • يهاجر الملفوف الفائق ، وهو الأكثر إحكاما ، إلى مسافة أبعد بكثير من الحجم المتوقع.

سأختتم من صورتك ما يلي:

  1. أن التخفيضات HindIII فعالة ، وأنها خطية تقريبًا كل البلازميد الخاص بك.
  2. تقوم BamHI بالقطع ، ولكن ليس بكفاءة مثل HindIII (على الأرجح) لنفس القدر من الوقت. يجب هضم هذا لفترة أطول إذا كان من المهم حقًا هضمه باستخدام BamHI فقط ، ولكن لأغراض التشخيص ، فهو جيد. أقول هذا بسبب النطاقات الخافتة التي شوهدت في

إذا كانت هذه عينات مهمة ، فسأفكر في تنقيتها باستخدام طرق أكثر نظافة ، على سبيل المثال باستخدام عمود.


مناقشة

أثبت الرحلان الكهربائي للهلام من Agarose أنه وسيلة فعالة وفعالة لفصل الأحماض النووية. تسمح قوة الهلام العالية لـ Agarose بمعالجة المواد الهلامية ذات النسبة المنخفضة لفصل شظايا الحمض النووي الكبيرة. يتم تحديد النخل الجزيئي من خلال حجم المسام الناتجة عن حزم agarose 7 في مصفوفة الهلام. بشكل عام ، كلما زاد تركيز الاغاروز ، كلما كان حجم المسام أصغر. هلام الاغاروز التقليدي هو الأكثر فعالية في فصل أجزاء الحمض النووي بين 100 و 25 كيلو بايت. لفصل أجزاء الحمض النووي التي يزيد حجمها عن 25 كيلو بايت ، سيحتاج المرء إلى استخدام الرحلان الكهربائي للهلام النبضي 6 ، والذي يتضمن تطبيق التيار المتردد من اتجاهين مختلفين. وبهذه الطريقة يتم فصل أجزاء الحمض النووي الأكبر حجمًا بالسرعة التي تعيد بها توجيه نفسها مع التغيرات في الاتجاه الحالي. يتم فصل شظايا الحمض النووي الأصغر من 100 زوج قاعدي بشكل أكثر فاعلية باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد. على عكس المواد الهلامية agarose ، يتم تشكيل مصفوفة هلام بولي أكريلاميد من خلال تفاعل كيميائي مدفوع بالجذور الحرة. هذه المواد الهلامية الرقيقة ذات تركيز أعلى ، ويتم تشغيلها عموديًا ولها دقة أفضل. في تسلسل الحمض النووي الحديث ، يتم استخدام الرحلان الكهربائي الشعري ، حيث تمتلئ الأنابيب الشعرية بمصفوفة هلامية. يسمح استخدام الأنابيب الشعرية بتطبيق الفولتية العالية ، وبالتالي تمكين فصل أجزاء الحمض النووي (وتحديد تسلسل الحمض النووي) بسرعة.

يمكن تعديل Agarose لإنشاء agarose منخفض الانصهار من خلال hydroxyethylation. يستخدم [اغروس) منخفض الانصهار بشكل عام عندما يكون عزل شظايا الحمض النووي المنفصلة مرغوباً فيه. يقلل Hydroxyethylation من كثافة التعبئة لحزم agarose ، مما يقلل بشكل فعال من حجم المسام 8. هذا يعني أن جزء الحمض النووي من نفس الحجم سيستغرق وقتًا أطول للتحرك عبر هلام الاغاروز منخفض الذوبان بدلاً من هلام الاغاروز القياسي. نظرًا لأن الحزم ترتبط ببعضها البعض من خلال التفاعلات غير التساهمية 9 ، فمن الممكن إعادة صهر هلام الاغاروز بعد أن يتم ضبطه.

EtBr هو الكاشف الأكثر شيوعًا المستخدم في تلطيخ الحمض النووي في مواد هلامية الاغاروز 10. عند التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية ، يتم تنشيط الإلكترونات الموجودة في الحلقة العطرية لجزيء الإيثيديوم ، مما يؤدي إلى إطلاق الطاقة (الضوء) مع عودة الإلكترونات إلى الحالة الأرضية. يعمل EtBr عن طريق إقحام نفسه في جزيء الحمض النووي بطريقة تعتمد على التركيز. يسمح هذا بتقدير كمية الحمض النووي في أي نطاق DNA معين بناءً على شدته. بسبب شحنته الإيجابية ، فإن استخدام EtBr يقلل من معدل انتقال الحمض النووي بنسبة 15 ٪. EtBr هو مطفر ومسرطن مشتبه به ، لذلك يجب على المرء توخي الحذر عند التعامل مع المواد الهلامية التي تحتوي على الاغاروز. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر EtBr نفايات خطرة ويجب التخلص منها بشكل مناسب. تشمل البقع البديلة للحمض النووي في هلام الاغاروز SYBR Gold و SYBR green و Crystal Violet و Methyl Blue. من بين هؤلاء ، لا يتطلب الميثيل الأزرق والبنفسجي الكريستالي تعريض الهلام لضوء الأشعة فوق البنفسجية لتصور نطاقات الحمض النووي ، مما يقلل من احتمال حدوث طفرة إذا كان استرداد جزء الحمض النووي من الجل مطلوبًا. ومع ذلك ، فإن حساسيتهم أقل من حساسية EtBr. يعتبر كل من SYBR gold و SYBR green أصباغ حساسة للغاية تعتمد على الأشعة فوق البنفسجية مع سمية أقل من EtBr ، لكنها أغلى بكثير. علاوة على ذلك ، فإن جميع الأصباغ البديلة إما لا يمكن أن تعمل بشكل جيد أو لا تعمل بشكل جيد عند إضافتها مباشرة إلى الجل ، لذلك يجب أن يكون الجل ملطخًا بعد الرحلان الكهربائي. بسبب التكلفة وسهولة الاستخدام والحساسية ، لا يزال EtBr هو الصبغة المفضلة للعديد من الباحثين. ومع ذلك ، في حالات معينة ، مثل عندما يكون التخلص من النفايات الخطرة أمرًا صعبًا أو عندما يقوم الطلاب الصغار بإجراء تجربة ، قد يُفضل استخدام صبغة أقل سمية.

صبغات التحميل المستخدمة في الرحلان الكهربائي للهلام تخدم ثلاثة أغراض رئيسية. أولاً يضيفون كثافة للعينة ، مما يسمح لها بالغرق في الهلام. ثانيًا ، توفر الأصباغ اللون وتبسط عملية التحميل. أخيرًا ، تتحرك الأصباغ بمعدلات قياسية عبر الهلام ، مما يسمح بتقدير المسافة التي هاجرتها شظايا الحمض النووي.

يمكن تحديد الأحجام الدقيقة لشظايا الحمض النووي المنفصلة عن طريق رسم سجل الوزن الجزيئي للنطاقات المختلفة لمعيار الحمض النووي مقابل المسافة التي يقطعها كل نطاق. يحتوي معيار الحمض النووي على مزيج من أجزاء الحمض النووي ذات الأحجام المحددة مسبقًا والتي يمكن مقارنتها مع عينات الحمض النووي غير المعروفة. من المهم ملاحظة أن أشكالًا مختلفة من الحمض النووي تتحرك عبر الهلام بمعدلات مختلفة. الحمض النووي البلازميدي فائق الالتواء ، بسبب شكله المضغوط ، يتحرك عبر الهلام بشكل أسرع ، متبوعًا بجزء خطي من الحمض النووي بنفس الحجم ، مع انتقال الشكل الدائري المفتوح أبطأ.

في الختام ، منذ اعتماد المواد الهلامية agarose في السبعينيات من القرن الماضي لفصل الحمض النووي ، فقد أثبتت أنها واحدة من أكثر التقنيات فائدة وتنوعًا في أبحاث العلوم البيولوجية.


هضم الحمض النووي والرحلان الكهربائي

هضم الحمض النووي والفحص الكهربائي
في هذه التجربة ، سنقوم بعملية تسمى هضم الحمض النووي أو تُعرف أيضًا باسم الهضم المقيد. هضم التقييد هو إجراء يستخدم في البيولوجيا الجزيئية لإعداد الحمض النووي للتحليل أو المعالجة الأخرى. يطلق عليه أحيانًا اسم تجزئة الحمض النووي ، يصفه العلماء هارتل وجونز بهذه الطريقة: يمكن استخدام هذه التقنية الأنزيمية لشق جزيئات الحمض النووي في مواقع محددة ، مما يضمن أن جميع أجزاء الحمض النووي التي تحتوي على تسلسل معين لها نفس الحجم علاوة على ذلك ، كل جزء يحتوي على التسلسل المطلوب له التسلسل الموجود في نفس الموضع بالضبط داخل الجزء. تستخدم طريقة الانقسام فئة مهمة من إنزيمات شق الحمض النووي المعزولة بشكل أساسي من البكتيريا. تسمى هذه الإنزيمات نوكليازات داخلية مقيدة أو إنزيمات تقييدية ، وهي قادرة على شطر جزيئات الحمض النووي في المواضع التي توجد فيها تسلسلات قصيرة معينة من القواعد. غالبًا ما يتم تضخيم الحمض النووي الناتج بشكل انتقائي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يجعله أكثر ملاءمة للتقنيات التحليلية مثل الاغاروز الكهربائي للهلام ، والكروماتوغرافيا. يتم استخدامه في البصمات الجينية ، وتحليل RFLP. [1]

كما ذكرنا سابقًا ، في هذه التجربة ، سنستخدم إنزيمات تقييدية. إنزيمات التقييد أو نوكلياز التقييد هي إنزيمات معزولة من البكتيريا التي تتعرف على تسلسلات معينة في الحمض النووي ثم تقطع الحمض النووي لإنتاج شظايا تسمى شظايا التقييد. يلعبون دورًا مهمًا جدًا في بناء جزيئات الحمض النووي المؤتلف ، كما هو الحال في تجارب استنساخ الجينات. [2] تتعرف نوكليازات التقييد مثل EcoRI على متواليات متناظرة محددة وتشق رابطة فسفودايستر على كل خيط في هذا التسلسل. بعد الهضم باستخدام نوكلياز مقيد ، يمكن فصل شظايا الحمض النووي الناتجة عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ويمكن تقدير حجمها. يتم إنشاء خريطة التقييد باستخدام بيانات حجم الجزء لتحديد الموقع.


1.12: تقييد الهضم بالهلام الكهربائي - علم الأحياء

هضم التقييد + مقارنة الحمض النووي

مدرسة ماربل هيل الثانوية للدراسات الدولية ، برونكس

برنامج البحث الصيفي لمعلمي العلوم

موضوعات: البيئة المعيشية

درسان ليومان أو حصتان- 50 دقيقة. يجب أن يكون اليوم الثاني بالتزامن مع مختبر العلاقة والتنوع البيولوجي

قبل القيام بهذا النشاط ، يجب أن يكون الطلاب قد تعرّفوا بالفعل على الإنزيمات ودورها كمحفز للتفاعلات. أيضًا ، يجب أن يكون لدى الطلاب معرفة جيدة ببنية ووظيفة الحمض النووي.

أسئلة أساسية:

1: كيف يتم استخدام الهلام الكهربائي لمقارنة الكائنات الحية المختلفة؟

2: ما هو الدور الذي تلعبه إنزيمات التقييد في مقارنة الحمض النووي؟

3: ما هي تطبيقات تقنيات التكنولوجيا الحيوية في حياتنا اليومية؟

سيتمكن الطلاب من عمل ملخص مقيد وفهم استخداماته في المجال البيولوجي

سيتعلم الطلاب كيفية مقارنة الحمض النووي المختلف بناءً على حجمه

سيتمكن الطلاب من تشغيل التحليل الكهربائي للهلام لفهم العلاقة والتنوع البيولوجي بشكل أفضل

الأنشطة الموجهة حول الهدف (الأهداف):

هضم تقييد البلازميد pDsD / ie123 / ph1 / pycrt باستخدام 3 إنزيمات تقييدية مختلفة

قم بتشغيل هلام باستخدام الهضم

تحليل نتائج الهضم والهلام الكهربائي

ترتيب الأحداث للفصل الدراسي ، والوقت المخصص لكل حدث ، والعمل التحضيري المطلوب ، والمواد اللازمة.

أنا. افعل الآن (5 دقائق): ما هو الإنزيم؟ أعط أمثلة على المكان الذي تلعب فيه الإنزيمات دورًا.

إجابات غير مشروعة من الطلاب وناقش الأدوار المحددة التي تقوم بها الإنزيمات. اطرح أيضًا فكرة أن معظم أسماء الإنزيمات تنتهي بـ ``ase وأن لها علاقة باسم الجزيء المرتبط به (أي اللاكتاز - يكسر اللاكتوز)

ثانيًا. أدخل إنزيم التقييد (RE) (10 دقائق) - إنزيم محدد يقطع مواقع محددة من الحمض النووي. للمساعدة في شرح المفهوم بشكل أفضل ، استخدم تشبيهًا بالمقص. اطبع جزءًا من الحمض النووي ، تسلسل أحادي الحمض النووي من 20 قاعدة مع موقعين يحتويان على CCGG. اشرح كيف في تسلسل الحمض النووي ، يمكن أن يكون هناك إنزيم تقييد يبحث عن CCGG وعندما يجد الموقع ، يتم إجراء قطع بين C و G.

نشاط إنزيم التقييد (10 دقائق): في كل جدول ، سيتم إعطاء الطلاب في مجموعتهم تسلسلات من الحمض النووي:

سيكون لكل مجموعة أيضًا مقص يسمى إنزيم التقييد باستخدام شريط لاصق. هذه التسمية مهمة جدا! (يمكن استخدامه كمرجع خلال العام لتذكير الطلاب.)

اسمح للطلاب بالحصول على 5 دقائق للعثور على مواقع CCGG المحددة في تسلسل الحمض النووي الخاص بهم وبمجرد أن يصبحوا جاهزين للقيام بعملية القطع. تجول للتحقق ومعرفة ما إذا كان الطلاب قد قاموا بذلك بشكل صحيح.

ثالثا. (20 دقيقة) بعد أن يمر الطلاب بنشاط RE السريع ، اطرح السؤال: ما هو الدور الذي تلعبه إنزيمات التقييد؟ يجب استدعاء 2 من الطلاب للإجابة الصحيحة ، لقطع الحمض النووي في مواقع محددة.

أ. قدم نشاط ملخص التقييد. سيتم تزويد الطالب بإنزيم التقييد والحمض النووي. انشر في كل جدول نسخة مطبوعة من البلازميد ومواقع التقييد المختلفة. يقوم SacI بتقطيع الحمض النووي في موقعين بينما يقوم HincII بتقطيعه في موقع واحد. اطلب من الطلاب إجراء تنبؤات عن حجم الأجزاء بعد قطع كل إنزيم بالإضافة إلى القطع باستخدام كليهما معًا. ضمني واكتب على السبورة.

ب. سيقوم الطلاب بقطع DNA البلازميد (يجب أن يعرف الطلاب عن البلازميد في درس سابق) باستخدام إنزيمين تقييد مختلفين: SacI و HincII. يجب تحضير جميع المواد في وقت مبكر.

سيكون لكل مجموعة في مائدتها 20 ميكرولتر ، 5 ميكرولتر بلازميد DN ، 10 ميكرولتر ساسي ، و 10 ميكرولتر من HincII ، 1 مل من الماء.

بروتوكول ملخص قيود الطالب.

ضع علامة على 3 أنابيب إبندورف صغيرة: Sac I و HincII و SacI + HincII

في 3 أنابيب إبندورف صغيرة ، أضف 2.5 ميكرولتر من الماء و 2.5 ميكرولتر من BSA العازلة و 2.5 ميكرولتر من عازلة التقييد 4.

Pipet 5microliter من DNA البلازميد في جميع الأنابيب الثلاثة

Pipet 2.5 ميكرولتر من SacI في أنبوب SacI ، 2.5 ميكرولتر من HincII في أنبوب HincII و 2.5 من SacI و HincII في الأنبوب النهائي الثالث.

اسأل الطلاب عن سبب كون الإنزيم هو آخر الإنزيم الذي يتم إضافته إلى التفاعل؟

احتضان الهضم لمدة 20 دقيقة في حمام مائي 37 درجة.

رابعا.(10 دقائق) خلال فترة الانتظار ، قم بالمرور على الهلام الكهربائي. أظهر باور بوينت صغير مدته 10 دقائق على الرحلان الكهربائي للهلام. (انظر شرائح powerpoint المرفقة) النقاط الرئيسية التي يجب تجاوزها هي خصائص الحمض النووي ولماذا يعتبر الفصل الكهربائي للهلام مناسبًا تمامًا لفصل الحمض النووي. ما الذي يمكن استخدامه؟ قارن بين الكائنات الحية المختلفة - اذكر التطبيقات العملية مثل اختبار الأبوة والتحقيق في مسرح الجريمة.

الخامس(10 دقائق) بعد درس صغير عن الرحلان الكهربائي للهلام ، سيحصل الطلاب على هضم التقييد الخاص بهم و pipet في الجل.

الماصة 10 ميكرولتر من صبغة التحميل في كل أنبوب ، وتعيد تعليقها في كل مرة. احرص على تغيير الطرف في كل مرة حتى لا تلوث كل عينة.

بيبيت 10 ميكرولتر من سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت + في أقصى اليسار جيدا من الجل. ستقوم مجموعة واحدة بتحميل هلامهم في البئر التالي بعد العلامة. (يجب على عضو المجموعة رسم الجل وتحديد مكان تحميل العينات. اعرض مثالاً على السبورة) تم تصميم هذا ليكون في علبتين جل بحيث يشارك الطلاب الآبار.

بعد أن قامت كل مجموعة بتحميل عيناتها ، قم بتوصيل الحبال السلبية والإيجابية بمصدر الطاقة وتشغيل الجل عند 120 فولت. أخبر الطلاب أنك ستتوقف عن الجري عندما تصل الصبغة من السلم إلى ... بعيدًا عن النهاية. سيرون نتائجهم غدا.

السادس. (10 دقائق) الخلاصة: تصريح خروج 3-2-1 - عند توزيع كل طالب يجب أن يملأ ما يلي:

3 أشياء جديدة تعلمتها (عن الإنزيمات والحمض النووي والتكنولوجيا الحيوية)

2 سؤال لا يزال لديك

الشيء الوحيد الذي ستشاركه مع شخص ما الليلة

اليوم الثاني - تابع درس اليوم الأول:

افعل الآن: اكتب ملاحظتين تراهما من نتائج عينتك. صف الاختلافات في المكان الذي ترى فيه الحمض النووي لكل من SacI و HincII و SacI و HincII؟

راجع نتائج كل مجموعة. اعرض مثالاً لما يجب أن تكون عليه النتائج الصحيحة وناقش أسباب عدم حصول المجموعات التي لم تحصل على النتيجة على أي نتيجة. انتقل إلى الخطوات التي تم اتخاذها أثناء الهضم وتشغيل الجل. انظر الصورة المرفقة للتشغيل الصحيح للهلام.

اطلب من الطلاب الإجابة على الأسئلة الإرشادية التالية:

ما هو حجم الحمض النووي الذي كان نتيجة هضم SacI؟ هل كان توقعهم صحيحًا؟

ما هو حجم الحمض النووي الذي نتج عن هضم HincII؟ هل كان توقعهم صحيحًا؟

ما هو حجم الحمض النووي الذي نتج عن هضم SacI + HincII؟ هل كان توقعهم صحيحًا؟

اشرح النتائج التي تراها. لماذا لديك 1 فرقة DNA و 2 نطاقات DNA و 3 فرق DNA؟ يجب أن يوضح هذا السؤال ما إذا كان الطلاب لديهم فهم عام للهلام.

سيتم إنفاق باقي الفصل على الانتهاء من مختبر العلاقة والتنوع البيولوجي ، واختبار الرحلان الكهربائي 7-Gel. هذا القسم من المعمل هو نسخة مقص الورق لمعمل الرحلان الكهربائي للهلام. إنه إعداد مثالي لوصف الاختلافات والتشابهات في خلاصة التقييد الفعلي ونشاط الفصل الكهربائي للهلام الفعلي الذي قاموا به.

2.2 ج يمكن استخدام إنزيمات مختلفة لقطع ونسخ وتحريك أجزاء من الحمض النووي.

يمكن التعبير عن الخصائص التي تنتجها مقاطع الحمض النووي عندما يتم إدخال هذه الأجزاء في كائنات حية جديدة ، مثل البكتيريا.

2.2 د يمكن أن يؤدي إدخال أو حذف أو استبدال قطع الحمض النووي إلى تغيير الجينات. يمكن أن ينتقل الجين المتغير إلى كل خلية تتطور منه.

إن معرفة علم الوراثة تتيح مجالات جديدة للرعاية الصحية ، على سبيل المثال ، فإن العثور على الجينات ، التي قد تحتوي على طفرات يمكن أن تسبب المرض ، سيساعد في تطوير تدابير وقائية لمكافحة المرض. المواد ، مثل الهرمونات والإنزيمات ، من الكائنات الحية المعدلة وراثيًا قد تقلل من التكلفة والآثار الجانبية لاستبدال المواد الكيميائية المفقودة في الجسم.


سؤال شائع: لماذا أرى شرائط DNA إضافية على الجل بعد هضم التقييد؟

يمكن أن تكون هناك عدة أسباب مختلفة وراء ملاحظة نطاقات إضافية في ملخصك. For a discussion on this topic please refer to the video above.

Typically, off-target DNA bands are caused by either partial digestion or Star Activity. You need to compare your digestion to the expected DNA banding pattern. If the bands in both lanes are similar to the expected pattern and the additional bands are limited to spaces within the upper and lower bands of the expected pattern, the digestion is incomplete (partial). In this case, you may need to purify the DNA to remove any contaminants, use more enzyme and/or increase the incubation time to ensure complete digestion.

If the additional bands are also seen below the lowest band of the expected pattern, and expected bands are being cut, the digestion is likely to be exhibiting Star activity. Your reactions conditions are driving the enzyme to cleave additional, non-canonical DNA sequences. You should repeat the digestion under one, or more, of the following modified reactions conditions:
∙ Decrease the amount of enzyme
∙ Decrease the incubation time
∙ Increase the reaction volume
أو
∙ Use an appropriate NEB High Fidelity (HFTM) restriction enzyme


Restriction Enzyme Digest & Gel Electrophoresis of DNA

Restriction Enzyme Digest & Gel Electrophoresis of DNAdemonstrates how DNA can be specifically cut into fragments by restriction enzymes and then can be separated by fragment size on an agarose gel. Students use lambda DNA and different restriction enzymes to prepare four different DNA digestion patterns.

  • هيكل الحمض النووي
  • Restriction Enzyme Function and Use in Cloning
  • مبادئ الرحلان الكهربائي الهلامي

This field trip is categorized as an متوسط field trip, and is appropriate for students at a high school level or above who have had exposure to the concepts of molecular biology. Students that have had experience in the laboratory with micropipettes will be at a distinct advantage when they explore concepts that are fundamental to the way in which modern biotechnology works!

Length of Field Trip:2.5 to 3 hours

Cost of Field Trip: $144 for up to 16 students $9 for every additional student combine with Genetic Transformation & Bioluminescence for a great value! We can also take this field trip On the Road to you.


هلام الكهربائي

سيراجع محررونا ما قدمته ويحددون ما إذا كان ينبغي مراجعة المقالة أم لا.

هلام الكهربائي, any of several techniques used to separate molecules of DNA, RNA, or protein on the basis of their size or electric charge. Gel electrophoresis has a variety of applications for example, it is used in DNA fingerprinting and the detection of genetic variants and proteins involved in health and disease as well as in the detection and purification of nucleic acids and proteins for research. It is also used to aid in the detection of pathogens (disease-causing organisms) that may be present in blood or other tissues or in sources such as food. In many instances, nucleic acids or proteins that are detected and purified with gel electrophoresis are investigated further by means of DNA sequencing or mass spectrometry.

The gel electrophoresis apparatus consists of a gel, which is often made from agar or polyacrylamide, and an electrophoretic chamber (typically a hard plastic box or tank) with a cathode (negative terminal) at one end and an anode (positive terminal) at the opposite end. The gel, which contains a series of wells at the cathode end, is placed inside the chamber and covered with a buffer solution. The samples are then loaded into the wells with a pipette. The chamber is connected to a power supply that, when turned on, applies an electric field to the buffer. The electric field causes negatively charged molecules to migrate through the gel toward the anode. (DNA and RNA are negatively charged proteins must be treated with a detergent to give them a negative charge.) The molecules’ movement is influenced by the porous gel matrix such that larger, heavier molecules move relatively slowly, whereas smaller, lighter molecules move more quickly. The density of pores and the type of substance used to make the gel further influence the rate of molecule migration. Often a dyed “ladder,” or marker with multiple molecules of known and varying molecular weights, is run alongside experimental samples to serve as a reference for size. The dye enables the visualization of the marker as it moves through the gel samples typically are also dyed for visualization. A dye known as ethidium bromide, which fluoresces under ultraviolet light, frequently is used for crisp visualization of DNA samples.


Restriction mapping of recombinant λ DNA molecules using pulsed field gel electrophoresis

We have integrated pulsed field gel electrophoresis with the partial digestion strategy of Smith and Birnstiel (1976, الدقة الأحماض النووية. 3, 2387–2398) to generate a rapid and accurate method of restriction endonuclease mapping recombinant λ DNA molecules. Use of pulsed field gels dramatically improves the accuracy of size determination and resolution of DNA restriction fragments relative to standard agarose gels. Briefly, DNA is partially digested with restriction enzymes to varying extents and then hybridized with a radiolabeled oligonucleotide which anneals specifically to one of the λ cohesive (cos) ends, effectively end labeling only those digestion products containing that cos end. In this study, we have used an oligonucleotide hybridizing to the right cos end. DNA is then fractionated by pulsed field gel electrophoresis, the gel dried down, and cos end containing fragments visualized by autoradiography. Fragment sizes indicate the distances from the labeled cos end to each restriction site for the particular restriction enzyme employed. This procedure requires only minimal quantities of DNA and is applicable to all vectors utilizing λ cos ends.


شاهد الفيديو: gel electrophoresisBand pattern of DNA in Agarose gel electrophoresisDNA band in agarose gel (قد 2022).