معلومة

يمكن qPCR التمهيدي مع عدة أعمال عدم تطابق؟

يمكن qPCR التمهيدي مع عدة أعمال عدم تطابق؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم بتصميم مواد أولية لـ qPCR من مناطق محمية لعدد قليل من أنواع الأسماك المختلفة ، وذلك لأن التسلسل الجيني لأنواع الأسماك الخاصة بي غير متوفر حتى الآن في قاعدة بيانات NCBI.

هل من المقبول (هل يمكن أن يصلب التمهيدي إلى التسلسل المستهدف) إذا كانت البادئات بها العديد من عدم التطابق في الداخل ونحوها 5 '؟ في نهاية 3 ، يمكنني فقط تصميم التمهيدي مع 5 قواعد محفوظة كحد أقصى.

شكرا لك.


QPCR حساس للغاية ، لذلك لن أفعل ذلك. بدلاً من ذلك ، سأحصل على تلك المواد الأولية التي ذكرتها في سؤالك وبدلاً من ذلك استخدمها بدلاً من استخدام qpcr معهم. ثم أقوم بعمل بادئات جديدة خاصة بالمنطقة التي تريد عمل qpcr بناءً على التسلسل ، وميزة هذا أنك ستعرف الآن التسلسل وبالتالي سيكون لديك بادئات أفضل لـ qpcr.


مقارنات الحساسية والكفاءة التحليلية لمجموعات مسبار التمهيدي SARS-CoV-2 RT-qPCR

يجسد الانتشار الأخير لفيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) الحاجة الماسة لإجراء فحوصات تشخيصية دقيقة وسريعة للتدخلات السريرية والصحية العامة. حاليًا ، يتم استخدام العديد من فحوصات النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) في المختبرات السريرية والبحثية ومختبرات الصحة العامة. ومع ذلك ، فمن غير الواضح حاليًا ما إذا كانت نتائج الاختبارات المختلفة قابلة للمقارنة. كان هدفنا هو إجراء تقييمات مستقلة لمجموعات مسبار التمهيدي المستخدمة في أربعة فحوصات تشخيصية شائعة لـ SARS-CoV-2. من مقارناتنا بين الكفاءة التحليلية والحساسية لـ RT-qPCR ، نوضح أنه يمكن استخدام جميع مجموعات المسبار التمهيدي للكشف عن SARS-CoV-2 عند 500 نسخة من الحمض النووي الريبي الفيروسي لكل تفاعل. الاستثناء من ذلك هو مجموعة مسبار التمهيدي المؤكّد RdRp-SARSr (Charité) الذي يحتوي على حساسية منخفضة ، ربما بسبب عدم تطابق مع انتشار SARS-CoV-2 في التمهيدي العكسي. لم نعثر على دليل على تضخيم الخلفية مع عينات ما قبل COVID-19 أو تطور SARS-CoV-2 الأخير الذي يقلل من الحساسية. توصيتنا للاختبار التشخيصي لـ SARS-CoV-2 هي اختيار مقايسة ذات حساسية عالية ويتم استخدامها إقليمياً ، لتسهيل المقارنة بين النتائج.


مقدمة

أصبحت تقنية CRISPR / Cas9 تقنية تحرير الجينوم الرئيسية وتستخدم على نطاق واسع في أنواع مختلفة من الكائنات الحية لغرض تعديل الجينوم 1،2،3،4. في نظام CRISPR / Cas9 ، يتم توجيه نوكلياز Cas9 لاستهداف الحمض النووي الذي يحتوي على الشكل المجاور الأولي (PAM) بواسطة دليل واحد من الحمض النووي الريبي (sgRNA) ، ثم يشق كل من خيوط الحمض النووي المستهدف في موقع 3 نقطة أساس قبل مجرى تسلسل PAM ويولد ضعفًا. - فواصل حبلا (DSBs). هذا النوع من تحطم الحمض النووي ضار بالخلايا ويمكن أن يؤدي إلى حدوث طفرات أو موت الخلايا إذا تُرك دون إصلاح. بمجرد استشعارها ، سيتم إصلاح DSBs في الغالب عن طريق نوعين مختلفين من الآليات الجوهرية ، الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) أو الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) 5،6. يعتمد الأول على تسلسل متماثل كقالب إصلاح ويصلح فواصل الحمض النووي بطريقة عالية الدقة. وعادة ما يتم استخدامه لإدخال تعديلات محددة على الحمض النووي ، لتلبية احتياجات الدراسة الوظيفية للتنوع الجيني ، وخاصة في الاستخدام السريري. يتضمن الأخير ربطًا مباشرًا للنهايات المكسورة دون الحاجة إلى قالب متماثل وإصلاح فواصل الحمض النووي بطريقة معرضة للخطأ. عادةً ما يؤدي NHEJ إلى إدخال أو حذف غير متوقع للقواعد في الجينوم ، المسمى indel ، والذي من المرجح أن يعطل إطار القراءة المفتوحة للجين المستهدف. هذا يجعلها طريقة فعالة للغاية في تدمير التعبير الجيني للدراسة الوظيفية للجينات وفي السريرية لإزالة الجينات المسببة للأمراض 7،8.

عادة ، لأي غرض تجريبي ، يعد الفحص المسبق لـ sgRNAs لتحقيق كفاءة وخصوصية عالية في التحرير أمرًا ضروريًا ، وغالبًا ما يكون فحص الحيوانات المستنسخة أحادية الخلية أو النسل الذي يحمل أحداث التعديل المطلوبة إلزاميًا. تمت مناقشة التقنيات الحالية لتقييم كفاءة تحرير الجينوم ومقارنتها في مراجعة 9. تعتمد الطرق المستخدمة على نطاق واسع بشكل أساسي على تسلسل الحمض النووي أو نوكلياز غير متطابق محدد 9،10. تتضمن طريقة التسلسل Sanger تضخيم PCR وخطوات الاستنساخ للمنطقة المستهدفة قبل قراءة كل تسلسل DNA بشكل منفصل. يمكن أن توفر هذه الطريقة متعددة الخطوات معلومات مفصلة عن كل حدث طفرة يسببه نوكلياز ، ولكنها تستغرق وقتًا طويلاً ومكلفة ومرهقة 10. للتغلب على هذه العيوب ، تم تقديم algorism الحسابية لتحقيق التقدير الكمي لكفاءة التحرير بناءً على تسلسل Sanger المباشر لمزيج amplicon لمنطقة الحمض النووي المستهدفة. في حين تميل موثوقيتها إلى إعاقة التسلسل المتكرر حول موقع القطع وتعتمد بشكل كبير على نقاء منتج PCR وجودة تسلسل Sanger 11. تم أيضًا تطبيق تقنية تسلسل الحمض النووي من الجيل التالي (NGS) في تحديد طفرة الحمض النووي التي تسببها sgRNA الموجهة للنيوكلياز Cas9 نظرًا لقدرتها المتوازية الهائلة. تم تطوير العديد من المنصات على الإنترنت لتحليل بيانات NGS ، بما في ذلك CRISPR-GA 13 و BATCH-GE 14 و CRISPResso 15،16 و Cas-Analzer 17 و CRISPRMatch 18 وآخرون. ومع ذلك ، على الرغم من فعاليتها ، لا تزال هذه الأساليب القائمة على NGS تتطلب عمليات متعددة الخطوات ومكلفة من حيث الوقت والمال. تستخدم الطرق المحددة القائمة على نوكلياز عدم التطابق T7 نوكلياز داخلي 1 (T7E1) أو نوكلياز مساح لكسر عدم التطابق المتكون بين خيوط الحمض النووي التي تحتوي على اختلاف في التسلسل نشأ من قطع نوكلياز 19. إنها تتطلب فقط معدات معملية أساسية ولكنها لا تنطبق على المواقع متعددة الأشكال وتميل إلى فقدان طفرة النوكليوتيدات المفردة وكذلك عمليات الحذف الكبيرة 20. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير العديد من البدائل الأخرى مع التحسين في جوانب معينة ، بما في ذلك qEva-CRISPR 21 ، والانتقالات التي يسببها نوكلياز هندسيًا (ENIT) 22 ، وتحليل تعدد الأشكال القائم على تقييد نوكلياز Cas9 (RFLP) 23 ، والكشف المستقل عن طريق تحليل Amplicon ( IDAA) 24 وتردد تحرير الجينات PCR الرقمي (GEF-dPCR) 25. ومع ذلك ، فإن معظم الطرق متعددة الخطوات وتقدير كفاءة التحرير بناءً على منتج PCR المضخم مسبقًا القادم من الحمض النووي الجيني ولكن ليس مباشرة على الحمض النووي الجيني نفسه 9،10،11،12،13،14،15،16،17،18 ، 19،20،22،23،24. التسلسل والتحيز المعتمد على الطول الذي تم إدخاله أثناء تضخيم PCR سيؤثر بشكل لا مفر منه على دقة الكشف 26،27،28. علاوة على ذلك ، تتطلب العديد من الطرق أجهزة محددة ، مثل جهاز التفريد الكهربي 21،24 ، ونظام PCR الرقمي 25 ومنصة NGS 12،13،14،15،16،17،18 وهي باهظة الثمن وغير متوفرة بسهولة في معظم المختبرات. بالنسبة للتنميط الجيني للنسل وفحص استنساخ الخلية الواحدة ، بالإضافة إلى تسلسل سانجر والطرق القائمة على NGS 29،30 ، تم أيضًا تطوير العديد من الاستراتيجيات الأخرى خصيصًا لغرض التنميط الجيني بما في ذلك الانصهار عالي الدقة (HRM) 31 وتداخل قليل النوكليوتيد- PCR (ORNi- PCR) 32 وآخرون. في أسماك الزرد 33 والنبات 34 ، تم تطوير طرق تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل لفحص الطفرات ، لكن الدقة والحساسية المحدودة حدت من تطبيقاتها الواسعة.

هنا قمنا بتطوير طريقة قائمة على PCR في الوقت الحقيقي ، وهي اختبار تحرير الجينوم PCR (getPCR) من خلال الجمع بين حساسية Taq polymerase لعدم التطابق في التمهيدي 3 مع تقنية PCR في الوقت الحقيقي لقوتها في تقدير كمية الحمض النووي. تشير التطبيقات في خلايا Lenti-X 293 T على 9 أهداف من sgRNA إلى أن هذه التقنية يمكن أن تحدد كفاءة تحرير الجينوم بدقة في جميع حالات تحرير الجينوم بما في ذلك المستحثات المستحثة NHEJ و HDR وتحرير القاعدة. في غضون ذلك ، أظهرت هذه الطريقة قوة كبيرة في التنميط الجيني للخلية الواحدة من خلال قدرتها على معرفة عدد الأليلات التي تم تعديلها بالضبط. توفر هذه التقنية الموصوفة هنا الإستراتيجية الأكثر قوة حتى الآن والتي يمكن استخدامها ليس فقط في تحديد كمية كفاءة تحرير الجينوم ولكن أيضًا التنميط الجيني للخلية المفردة بطريقة إنتاجية عالية.


تصميم و تنفيذ

لتعظيم الاستفادة من موارد الخادم ، تم تنفيذ PCRTiler كتطبيق متعدد الخيوط يقوم بتصميم العديد من أزواج التمهيدي في نفس الوقت مثل الخادم الذي يحتوي على معالجات. يتم وضع طلبات التجانب المستقلة في قائمة الانتظار حتى تنتهي مهمة التجانب المنفذة حاليًا. سيتم إخطار المستخدمين الذين يقدمون عنوان بريد إلكتروني عند انتهاء معالجة طلباتهم. سيتعين على الآخرين استخدام الرابط الموجود في صفحة تأكيد الإرسال لعرض نتائجهم.

لتعزيز الاستخدام العادل للنظام ، فإن العدد الإجمالي للأزواج التمهيدي التي يمكن تصميمها في طلب واحد يقتصر على 200 ، ويتم تعيين الحد الأقصى لمدة مهمة التبليط على ثلاث ساعات. لا يزال بإمكان المستخدمين الذين يتجاوزون هذه الحدود استخدام PCRTiler ، إما عن طريق تثبيت تطبيق PCRTiler المستقل على أجهزة الكمبيوتر الشخصية الخاصة بهم ، أو تثبيت إصدار الخادم وتعطيل الحد ، أو تقسيم طلباتهم الكبيرة إلى مناطق أصغر.

سيتم استرداد PCRTiler بأمان من إعادة تشغيل الخادم. بمجرد إرسال طلبات التجانب الجديدة إلى الخادم ، يتم ضغطها ثم حفظها على القرص. في حالة إعادة تشغيل الخادم ، سيقوم برنامج PCRTiler باسترداد طلبات التجانب في قائمة الانتظار ، والحفاظ على ترتيبها الأصلي ، واستئناف تنفيذ التشغيل الذي تم إحباطه.

متطلبات البرامج والأجهزة

يتطلب PCRTiler تشغيل Java Runtime Environment (JRE) v1.6.0 و Tomcat 6 على جهاز كمبيوتر يستخدم نظام التشغيل Linux. يجب أن يعمل أيضًا نظريًا على أي مجموعة من الأنظمة الأساسية وأنظمة التشغيل التي توجد لها تطبيقات لثنائيات JRE و Tomcat 6 و Primer3 و BLAST ، لكن هذا لم يتم اختباره وبالتالي فهو غير مدعوم. أثناء الاختبار ، تحققنا من أنه يتصرف بشكل صحيح عند عرضه بأحدث إصدارات Firefox و Safari و Internet Explorer.

يعتمد أداء PCRTiler بشكل أساسي على الذاكرة المتوفرة. في تجربتنا ، للحصول على أداء مقبول ، تحتاج إلى ذاكرة كافية لقاعدة بيانات BLAST (800 ميجابايت لـ الانسان العاقل، 5 ميجا بايت لمعظم البكتيريا) ، بالإضافة إلى 1 جيجا بايت كحد أقصى لـ PCRTiler. لذلك ، 2 غيغابايت من الذاكرة يجب أن تكون كافية. يتم تضمين هذا القدر من الذاكرة بشكل شائع في أجهزة الكمبيوتر وأجهزة الكمبيوتر المحمولة الخاصة بمحطات العمل الحديثة. PCRTiler هو تطبيق متعدد الخيوط ، لذلك سوف يستفيد من جميع أنوية وحدة المعالجة المركزية المتاحة ، مما يسرع تصميم التمهيدي بشكل متناسب مع عدد النوى. يعمل خادم PCRTiler حاليًا على تشغيل Mandriva Linux 2010 على جهاز Intel رباعي النواة مخصص بسرعة 2.4 جيجا هرتز مع 4 جيجا بايت من ذاكرة الوصول العشوائي. بما في ذلك قواعد بيانات بلاست لجميع الجينومات البالغ عددها 1169 ، يتطلب PCRTiler & lt15 جيجابايت من مساحة القرص الثابت.

نسخة مستقلة

بالإضافة إلى إصدار الخادم ، نقدم تطبيقًا قائمًا على Java قائم بذاته ، والذي يتضمن واجهة مستخدم رسومية ونفس ميزة إدارة الجينوم بنقرة واحدة مثل إصدار الخادم. كما أنه يتعامل مع جميع جوانب تنزيل الجينوم من GenBank وإنشاء قواعد بيانات بلاست. نظرًا لأن الإصدارات المستقلة وإصدارات الخادم تشترك في الكثير من نفس قاعدة التعليمات البرمجية ، فإن كلاهما يوفر نفس الوظيفة. ومع ذلك ، يستخدم الإصدار المستقل موارد جهاز الكمبيوتر العميل. يعد استخدام الإصدار المستقل هو الخيار الأسهل لمعظم المستخدمين الذين يرغبون في تشغيل برنامج PCRTiler محليًا. يرجى ملاحظة أن الإصدار المستقل لا يتطلب Tomcat. حتى الآن ، ثبت أنه يعمل بشكل صحيح على Linux i386 و Windows Vista و Windows XP.

الاحتفاظ بالبيانات

يتم الاحتفاظ بنتائج PCRTiler على الخادم لمدة 14 يومًا. ومع ذلك ، لدى المستخدمين خيار حذف ملف النتائج الخاص بهم من الخادم فورًا باستخدام الزر المناسب في صفحة النتائج. يمكن للمستخدمين الذين يرغبون في الاحتفاظ بنتيجة PCRTiler لفترة زمنية أطول تنزيل ملف النتائج الأولية من موقع الويب ، والذي يمكن عرضه باستخدام الإصدار المستقل من PCRTiler.


لتصميم مجموعتك الخاصة من البادئات المتدهورة ، اتبع بعض الإرشادات الأساسية:

15-20 زوجًا أساسيًا.
5) حاول تضمين الأحماض الأمينية الميثيونين والتريبتوفان ، والتي تم ترميزها بواسطة كودون واحد (رمز النوكليوتيدات المكون من ثلاثة أحرف) ، وتجنب الأحماض الأمينية ليسين وسيرين وأرجينين ، والتي يمكن ترميز كل منها بستة مجموعات كودون (الجدول 2).
6) لإجراءات الاستنساخ اللاحقة ولزيادة طول التمهيدي (وبالتالي درجة حرارة التلدين) أضف ذيلًا بحجم 5 بوصات (6-9 أزواج قاعدية) يحتوي على موقع إنزيم مقيد.
7) إذا كان هناك انحلال كامل (لا يوجد تطابق بين أي نوع معين) ، ففكر في استخدام قاعدة إينوزين (مشابه هيكليًا للجوانين) حيث يمكن أن يقترن بأي من القواعد الأربعة ، على الرغم من أنه سيرتبط بالسيتوزين بشكل تفضيلي. بدلاً من ذلك ، أدخل N لقاعدة aNy لضمان تركيزات متساوية لكل قاعدة في هذا الموضع في مزيج التمهيدي.
8) تجنب الانحطاط عند الطرف الثالث (لن يكون هذا مكانًا جيدًا لإدخال إينوزين).

اعتمادًا على الهدف ، يمكن تعديل المباراة الفاصلة بين خصوصية وكفاءة التمهيدي عن طريق تغيير انحطاط التمهيدي. على سبيل المثال ، كلما كانت البادئات أكثر انحطاطًا ، كلما كان التلدين أقل تحديدًا ، وسيسمح انخفاض الانحطاط بإمكانية أكبر لتحديد المتغيرات غير المعروفة.


1 SequenceTracer يزيل التسلسلات المفقودة في ROI. تم توضيح معيار استبعاد التسلسلات المفقودة بالموافقة التحريرية بعد قبول المرحلة الأولى وقبل مراقبة البيانات.

2 تم تحديد الحد الأدنى قبل قبول المرحلة الأولى. ومع ذلك ، لم يتم ذكرها بوضوح في بروتوكول المرحلة الأولى وتمت الإشارة إلى دراسة سابقة فقط.

المواد التكميلية الإلكترونية متاحة على الإنترنت على https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5012597.

تم النشر بواسطة الجمعية الملكية بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ، والتي تسمح بالاستخدام غير المقيد ، بشرط ذكر المؤلف والمصدر الأصليين.

مراجع

2020 فيروس كورونا جديد مرتبط بأمراض الجهاز التنفسي البشري في الصين. طبيعة سجية 579، 265-269. (دوى: 10.1038 / s41586-020-2008-3) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2020 تفشي الالتهاب الرئوي المرتبط بفيروس كورونا جديد من أصل محتمل للخفافيش. طبيعة سجية 579، 270-273. (دوى: 10.1038 / s41586-020-2012-7) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2020 فيروس كورونا جديد من مرضى الالتهاب الرئوي في الصين ، 2019. إنجل. جيه ميد. 382، 727-733. (دوى: 10.1056 / NEJMoa2001017) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2020 مجموعة عائلية من الالتهاب الرئوي مرتبطة بفيروس كورونا الجديد لعام 2019 تشير إلى انتقال العدوى من شخص لآخر: دراسة عن مجموعة عائلية. لانسيت 395، 514-523. (دوى: 10.1016 / S0140-6736 (20) 30154-9) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2020 تشير مجموعة العدوى العائلية المرتبطة بفيروس كورونا الجديد لعام 2019 إلى احتمال انتقال العدوى من شخص لآخر خلال فترة الحضانة. J. تصيب. ديس. 221، 1757-1761. (دوى: 10.1093 / infdis / jiaa077) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2020 توصيف الجينوم وعلم الأوبئة لفيروس كورونا الجديد 2019: الآثار المترتبة على أصول الفيروس وربط المستقبلات. لانسيت 395، 565-574. (دوى: 10.1016 / S0140-6736 (20) 30251-8) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2020 تشخيص جزيئي محسّن لـ COVID-19 من خلال اختبار COVID-19-RdRp / Hel للنسخ العكسي للنسخ العكسي في الوقت الحقيقي والذي تم التحقق من صحته في المختبر ومع العينات السريرية. J. كلين. ميكروبيول. 58، e00310-20. (دوى: 10.1128 / JCM.00310-20) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2020 المظاهر السريرية للمرضى المصابين بفيروس كورونا الجديد 2019 في ووهان ، الصين. لانسيت 395، 497-506. (دوى: 10.1016 / S0140-6736 (20) 30183-5) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2020 الأداء المقارن لفحوصات الكشف عن SARS-CoV-2 باستخدام سبع مجموعات مختلفة من التمهيدي / المسبار ومجموعة فحص واحدة. J. كلين. ميكروبيول. 58، e00557-20. (دوى: 10.1128 / JCM.00557-20) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

نيو P ، لو R ، Zhao L ، Wang H ، Huang B ، Ye F ، Wang W ، Tan W

. 2020 ثلاثة فحوصات جديدة في الوقت الحقيقي من RT-PCR للكشف عن فيروس COVID-19. مركز السيطرة على الأمراض الصيني الأسبوعي. منحة جوجل

2020 تطوير بروتوكول اكتشاف آمن ومختبري منخفض التكلفة لـ SARS-CoV-2 لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19). إكسب. نيوروبيول. 29، 107-119. (دوى: 10.5607 / en20009) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2020 تطوير اختبار RT-PCR في الوقت الحقيقي مشتق من طرح الجينوم ومشتق من السارس COV-2 وتقييمه باستخدام العينات السريرية. كثافة العمليات جيه مول. علوم. 21، 2574. (دوى: 10.3390 / ijms21072574) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

2020 السمات الوبائية والمسار السريري للمرضى المصابين بفيروس SARS-CoV-2 في سنغافورة. جاما 323، 1488-1494. (دوى: 10.1001 / jama.2020.3204) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Lippi G ، Simundic AM ، Plebani M

. 2020 نقاط الضعف التحليلية والتحليلية المحتملة في التشخيص المختبري لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19). كلين. تشيم. مختبر. ميد. (دوى: 10.1515 / cclm-2020-0285) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

. 2005 اختلاف التسلسل في أهداف التمهيدي يؤثر على دقة PCR الكمي الفيروسي. J. كلين. فيرول. 34، 104-107. (دوى: 10.1016 / j.jcv.2005.02.010) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2019 اكتشافات مفقودة لأنفلونزا A (H1) pdm09 عن طريق مقايسة RT-PCR في الوقت الفعلي بسبب طفرة تسلسل الهيماجلوتينين ، من ديسمبر 2017 إلى مارس 2018 ، شمال فيتنام. ويسترن باك. مسح. الرد J . 10، 32-38. (دوى: 10.5365 / wpsar.2018.9.3.003) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

كلونجثونج C ، Chinnawirotpisan P ، حسام K ، Phonpakobsin T ، Manasatienkij W ، Ajariyakhajorn C ، Rungrojcharoenkit K ، Gibbons RV ، Jarman RG

. 2010 تأثير عدم تطابق التمهيدي وقالب التحقيق على حساسية الكشف عن فيروس الأنفلونزا الجائحة A / H1N1 / 2009 بواسطة RT-PCR في الوقت الفعلي. J. كلين. فيرول. 48، 91-95. (دوى: 10.1016 / j.jcv.2010.03.012) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

لي هونج كونج ، لي سي كيه ، لوه تي بي ، تشيانغ دي ، كواي إس ، تانغ جي دبليو

. 2011 تشخيص مفقود لفيروس الأنفلونزا B بسبب طفرات تسلسل البروتين النووي ، سنغافورة ، أبريل 2011. مسح اليورو. 16، 19943. PubMed ، الباحث العلمي من Google

2014 الطفرات الناشئة حديثًا في جينات المصفوفة من فيروسات الأنفلونزا البشرية A (H1N1) pdm09 و A (H3N2) تقلل من حساسية الكشف عن النسخ العكسي في الوقت الحقيقي- PCR. J. كلين. ميكروبيول. 52، 76-82. (دوى: 10.1128 / JCM.02467-13) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Kamau E و Agoti CN و Lewa CS و Oketch J و Owor BE و Otieno GP و Bett A و Cane PA و Nokes DJ

. أثر التباين الأخير في التسلسل لعام 2017 في موقع ربط المجس على اكتشاف مجموعة الفيروس المخلوي التنفسي B بواسطة RT-PCR في الوقت الفعلي. J. كلين. فيرول. 88، 21-25. (دوى: 10.1016 / j.jcv.2016.12.011) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Koo C، Kaur S، Teh ZY، Xu H، Nasir A، Lai YL، Khan E، Ng LC، Hapuarachchi HC

. يشرح التباين الوراثي لعام 2016 في مناطق ربط المسبار النتائج السلبية الخاطئة للمقايسة الجزيئية للكشف عن فيروس حمى الضنك. ناقلات الأمراض الحيوانية المنشأ المنقولة. 16، 489-495. (دوى: 10.1089 / vbz.2015.1899) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

هيوز جي جي ، سميث جي إس ، هانلون كاليفورنيا ، روبريخت سي

. 2004 تقييم مقايسة TaqMan PCR لاكتشاف الحمض النووي الريبي لفيروس داء الكلب: تأثير اختلاف التسلسل والتطبيق على القياس الكمي للأحمال الفيروسية. J. كلين. ميكروبيول. 42، 299-306. (دوى: 10.1128 / jcm.42.1.299-306.2004) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

كريستوفرسون سي ، سنينسكي جي ، كووك إس

. 1997 آثار عدم تطابق قالب التمهيدي الداخلي على RT-PCR: دراسات نموذج HIV-1. الدقة الأحماض النووية. 25، 654-658. (دوى: 10.1093 / nar / 25.3.654) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Acharya A، Vaniawala S، Shah P، Parekh H، Misra RN، Wani M، Mukhopadhyaya PN

. 2014 مقايسة قوية للكشف عن الحمل الفيروسي HIV-1 مُحسَّنة للسلالات الهندية من النوع الفرعي C المحدد وإعداد الحد من الموارد. بيول. الدقة. 47، 22. (دوى: 10.1186 / 0717-6287-47-22) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Liu C و Chang L و Jia T و Guo F و Zhang L و Ji H و Zhao J و Wang L

. قد تتطلب فحوصات PCR في الوقت الحقيقي لعام 2017 لتقدير الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B هدفين مختلفين. فيرول. ج. 14، 94. (دوى: 10.1186 / s12985-017-0759-8) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

تشاو سي كيه ، كين K ، لاو إل تي ، تشيونغ هوي يو أ

. 2011 أهمية عدم تطابق التمهيدي أحادي النوكليوتيدات في فحوصات تشخيص تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لفيروس التهاب الكبد B. J. كلين. ميكروبيول. 49، 4418-4419 رد المؤلف 4420. (doi: 10.1128 / JCM.05224-11) Crossref، PubMed، ISI، Google Scholar

Chan JF ، Kok KH ، Zhu Z ، Chu H ، إلى KK ، Yuan S ، Yuen KY

. 2020 التوصيف الجينومي لفيروس كورونا الجديد الممرض للإنسان لعام 2019 المعزول من مريض مصاب بالتهاب رئوي غير نمطي بعد زيارة ووهان. إميرج. الميكروبات تصيب. 9، 221-236. (دوى: 10.1080 / 22221751.2020.1719902) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Ogando NS ، Ferron F ، Decroly E ، Canard B ، Posthuma CC ، Snijder EJ

. 2019 الحالة الغريبة لفيروس nidovirus exoribonuclease: دوره في تخليق RNA وإخلاص النسخ المتماثل. أمام. ميكروبيول. 10، 1813. (دوى: 10.3389 / fmicb.2019.01813) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

سميث إي سي ، سيكستون إن آر ، دينيسون إم آر

. 2014 التفكير خارج المثلث: تكرار الإخلاص لأكبر فيروسات الحمض النووي الريبي. Annu. القس فيرول. 1، 111-132. (دوى: 10.1146 / annurev-virology-031413-085507) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2020 التحليل الوراثي للحالات الأربع الأولى لـ SARS-CoV-2 في تشيلي. جيه ميد. فيرول. (دوى: 10.1002 / jmv.25797) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

فورستر بي ، فورستر إل ، رينفرو سي ، فورستر إم

. 2020 تحليل شبكة النشوء والتطور لجينومات SARS-CoV-2. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 117، 9241-9243. (دوى: 10.1073 / pnas.2004999117) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2020 التنوع الجيني وتطور SARS-CoV-2. تصيب. جينيه. Evol. 81، 104260. (دوى: 10.1016 / j.meegid.2020.104260) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2020 حول أصل وتطور SARS-CoV-2. ناتل سسي. القس. nwaa036. (دوى: 10.1093 / nsr / nwaa036) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

وانغ سي ، ليو زد ، تشن زد ، هوانغ إكس ، شو إم ، هي تي ، تشانغ زد

. 2020 إنشاء تسلسل مرجعي لـ SARS-CoV-2 وتحليل التباين. جيه ميد. فيرول. 92، 667-674. (دوى: 10.1002 / jmv.25762) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من جوجل

2020 فيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) جين RT-PCR N في الوقت الحقيقي 2020 (اختبار متعلق بـ Wuhan-N 2019-nCoV). Protocols.io. (دوى: 10.17504 / protocols.io.bchwit7e) الباحث العلمي من Google

شارفستين جم ، بيكر سج ، ميلو مم

. 2020 الاختبارات التشخيصية لفيروس كورونا الجديد. جاما 323، 1437. (doi: 10.1001 / jama.2020.3864) Crossref، ISI، Google Scholar

وانغ إكس ، ياو إتش ، شو إكس ، زانغ بي ، زانغ إم ، شاو جي ، إكسياو واي ، وانغ إتش

. 2020 حدود الكشف عن ست مجموعات RT-PCR معتمدة لفيروس SARS-Coron-2 الجديد (SARS-CoV-2). كلين. تشيم. (دوى: 10.1093 / clinchem / hvaa099) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

Li D و Wang D و Dong J و Wang N و Huang H و Xu H و Xia C

. 2020 النتائج السلبية الكاذبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الحقيقي لمتلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة فيروس كورونا 2: دور التشخيص المقطعي القائم على التعلم العميق والرؤى من حالتين. كوري جيه راديول. 21، 505-508. (دوى: 10.3348 / kjr.2020.0146) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Chen Z، Li Y، Wu B، Hou Y، Bao J، Deng X

. 2020 مريض مصاب بـ COVID-19 يقدم نتيجة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخة العكسية السلبية الكاذبة. كوري جيه راديول. 21، 623. (دوى: 10.3348 / kjr.2020.0195) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Li Y، Yao L، Li J، Chen L، Song Y، Cai Z، Yang C

. قضايا الاستقرار لعام 2020 الخاصة باختبار RT-PCR لـ SARS-CoV-2 للمرضى المقيمين في المستشفى الذين تم تشخيصهم سريريًا بـ COVID-19. جيه ميد. فيرول. (دوى: 10.1002 / jmv.25786) ISI ، الباحث العلمي من Google

Dong X، Cao YY، Lu XX، Zhang JJ، Du H، Yan YQ، Akdis CA، Gao YD

. 2020 أحد عشر وجهاً من مرض فيروس كورونا 2019. حساسية. (دوى: 10.1111 / all.14289) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

Ai T و Yang Z و Hou H و Zhan C و Chen C و Lv W و Tao Q و Sun Z و Xia L

. 2020 ارتباط اختبار الصدر بالأشعة المقطعية و RT-PCR في مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) في الصين: تقرير عن 1014 حالة. الأشعة . (دوى: 10.1148 / radiol.2020200642) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Patel R، Babady E، Theel ES، Storch GA، Pinsky BA، St George K، Smith TC، Bertuzzi S

. 2020 تقرير من القمة الدولية للجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة COVID-19 ، 23 مارس 2020: قيمة الاختبار التشخيصي لـ SARS-CoV-2 / COVID-19. مبيو 11، e00722-20. (دوى: 10.1128 / mBio.00722-20) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

2020 الكشف عن فيروس كورونا الجديد 2019 (2019-nCoV) بواسطة RT-PCR في الوقت الحقيقي. مسح اليورو. 25، 2000045. (دوى: 10.2807 / 1560-7917.ES.2020.25.3.2000045) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

2020 تطوير طرق التشخيص الجيني لفيروس كورونا الجديد 2019 (nCoV-2019) في اليابان. JPn. J. تصيب. ديس. (دوى: 10.7883 / yoken.JID.2020.061) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

2020 التشخيص الجزيئي لفيروس كورونا الجديد (2019-nCoV) تسبب في تفشي الالتهاب الرئوي. كلين. تشيم. 66، 549-555. (دوى: 10.1093 / clinchem / hvaa029) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2017 GISAID: مبادرة عالمية حول مشاركة جميع بيانات الأنفلونزا - من الرؤية إلى الواقع. مسح اليورو. 22، 30494. (دوى: 10.2807 / 1560-7917.ES.2017.22.13.30494) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Das J ، Do Q-T ، Shaines K ، Srikant S

. 2013 الولايات المتحدة وهم: جغرافية البحث الأكاديمي. J. ديف. اقتصاد. 105، 112-130. (دوى: 10.1016 / j.jdeveco.2013.07.010) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

2017 الاتجاهات المتغيرة والتحيزات المستمرة في ثلاثة عقود من علم الحفظ. الكرة الأرضية. ايكول. كونسيرف. 10، 32-42. (دوى: 10.1016 / j.gecco.2017.01.008) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

. 2020 مواكبة أحدث أبحاث فيروس كورونا. طبيعة سجية 579، 193. (دوى: 10.1038 / d41586-020-00694-1) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

عرب زوزاني م ، حسانيبور س

. 2020 ميزات وقيود مركز LitCovid للوصول السريع إلى الأدبيات حول COVID-19. البلقان ميد. ج. (دوى: 10.4274 / balkanmedj.galenos.2020.2020.4.67) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Katoh K، Misawa K، Kuma K، Miyata T

. 2002 MAFFT: طريقة جديدة للمحاذاة السريعة متعددة التسلسلات بناءً على تحويل فورييه السريع. الدقة الأحماض النووية. 30، 3059-3066. (دوى: 10.1093 / nar / gkf436) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Katoh K ، Rozewicki J ، Yamada KD

. خدمة 2019 MAFFT عبر الإنترنت: محاذاة تسلسل متعدد واختيار تسلسل تفاعلي وتصور. موجز Bioinform. 20، 1160-1166. (دوى: 10.1093 / bib / bbx108) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

. 2014 AliView: عارض محاذاة سريع وخفيف الوزن ومحرر لمجموعات البيانات الكبيرة. المعلوماتية الحيوية 30، 3276-3278. (دوى: 10.1093 / المعلوماتية الحيوية / btu531) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

ناجي أ ، جيرينك تي ، جيرينكوفا إتش ، سيرنيكوفا إل ، هافليكوفا إم

. 2019 في إعادة تقييم السيليكو لمقايسة RT-qPCR التشخيصية للكشف الشامل عن فيروسات الإنفلونزا أ. علوم. اعادة عد. 9، 1630. (دوى: 10.1038 / s41598-018-37869-w) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Zhao Z و Li H و Wu X و Zhong Y و Zhang K و Zhang YP و Boerwinkle E و Fu YX

. 2004 معدل طفرة معتدل في جينوم فيروس سارس وتداعياته. BMC Evol. بيول. 4، 21. (دوى: 10.1186 / 1471-2148-4-21) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2020 التنوع الجيني لـ SARS-CoV-2 في مرضى فيروس كورونا 2019. كلين. تصيب. ديس. (دوى: 10.1093 / cid / ciaa203) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

. 2016 آليات الطفرة الفيروسية. زنزانة. مول. علوم الحياة. 73، 4433-4448. (دوى: 10.1007 / s00018-016-2299-6) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

كاراسكو-هيرنانديز آر ، جاكومي آر ، لوبيز فيدال واي ، بونس دي ليون إس

. 2017 هل فيروسات الحمض النووي الريبي عوامل مرشحة للوباء العالمي القادم؟ مراجعة . إيلار ج. 58، 343-358. (دوى: 10.1093 / ilar / ilx026) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

ليفيفر إس ، باتين إف ، هيلمانز جي ، فانديسومبيلي ج

. 2013 تعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات وأوجه عدم التطابق الأخرى تقلل من أداء فحوصات PCR الكمية. كلين. تشيم. 59، 1470-1480. (دوى: 10.1373 / clinchem.2013.203653) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Stadhouders R، Pas SD، Anber J، Voermans J، Mes TH، Schutten M

. 2010 تأثير عدم تطابق القالب التمهيدي على كشف وتقدير الأحماض النووية باستخدام مقايسة 5 نيوكلياز. جيه مول. التشخيص. 12، 109-117. (دوى: 10.2353 / jmoldx.2010.090035) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

ارمسترونج بيإم ، برينس ن ، أندريديس تي جي

. 2012 تطوير مقايسة TaqMan متعددة الأهداف للكشف عن متغيرات فيروس التهاب الدماغ الخيلي الشرقي في البعوض. ناقلات الأمراض الحيوانية المنشأ المنقولة. 12، 872-876. (دوى: 10.1089 / vbz.2012.1008) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Garson JA، Ferns RB، Grant PR، Ijaz S، Nastouli E، Szypulska R، Tedder RS

. يقلل تعديل رابط الأخدود البسيط لعام 2012 لمسبار TaqMan المستخدم على نطاق واسع لفيروس التهاب الكبد E من مخاطر نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) السلبية الكاذبة في الوقت الحقيقي. J. فيرول. أساليب. 186، 157-160. (دوى: 10.1016 / j.jviromet.2012.07.027) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

براولت إيه سي ، فانغ واي ، دانين إم ، أنيشينكو إم ، رايزن وك

. 2012 طفرة تحدث بشكل طبيعي داخل منطقة ربط المسبار تهدد اختبار مراقبة فيروس غرب النيل الجزيئي لأحواض البعوض (Diptera: Culicidae). جيه ميد. انتومول. 49، 939-941. (دوى: 10.1603 / me11287) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2020 مقارنات الحساسية والكفاءة التحليلية لمقايسات SARS-COV-2 qRT-PCR. medRxiv . (دوى: 10.1101 / 2020.03.30.20048108) الباحث العلمي من Google

West CP ، Montori VM ، Sampathkumar P

. 2020 اختبار COVID-19: التهديد بنتائج سلبية كاذبة. مايو كلين. بروك. 20، 30365-30367. (دوى: 10.1016 / j.mayocp.2020.04.004) الباحث العلمي من Google

Drame M ، Teguo MT ، Proye E ، Hequet F ، Hentzien M ، Kanagaratnam L ، Godaert L

. 2020 هل يجب اعتبار RT-PCR معيارًا ذهبيًا في تشخيص Covid-19؟ جيه ميد. فيرول. (دوى: 10.1002 / jmv.25996) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2020 BioLaboro: نظام معلوماتية حيوية لاكتشاف تآكل توقيع المقايسة الجزيئية وتصميم فحوصات جديدة استجابة لمسببات الأمراض الناشئة والعائدة. bioRxiv. (دوى: 10.1101 / 2020.04.08.031963) الباحث العلمي من Google

مقارنة 2020 باكتشاف SARS-CoV-2 من عينات مسحة البلعوم الأنفي بواسطة اختبار Roche cobas (R) 6800 SARS-CoV-2 واختبار RT-PCR في الوقت الحقيقي المطور في المختبر. جيه ميد. فيرول. (دوى: 10.1002 / jmv.25988) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2020 فسر بحذر: تقييم AusDiagnostics التجارية مقابل المقايسات المطورة داخليًا للكشف عن فيروس SARS-CoV-2. J. كلين. فيرول. 127، 104374. (دوى: 10.1016 / j.jcv.2020.104374) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ناجي أ ، جيرينك تي ، سيرنيكوفا إل ، جيرينكوفا إتش ، هافليكوفا م

. 2015 محاذاة تسلسل النوكليوتيدات على نطاق واسع وتقييم تقلب التسلسل لتحديد المناطق شديدة الحفظ تطوريًا لتصميم فحص PCR للفحص الشامل: مثال على فيروس الأنفلونزا أ. طرق مول. بيول. 1275، 57-72. (دوى: 10.1007 / 978-1-4939-2365-6_4) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

سنجر جي بي ، طومسون إي سي ، مكلوشلان جيه ، هيوز جيه ، جيفورد آر جيه

. 2018 GLUE: نظام برمجي مرن لبيانات تسلسل الفيروسات. BMC Bioinf. 19، 532. (دوى: 10.1186 / s12859-018-2459-9) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google


يمكن أن يكون لأعطال الجهاز بداية خبيثة وبالتالي يصعب تشخيصها. لمنع تكاليف الإصلاح الباهظة ، تأكد من أن جميع مشغلي الأدوات مدربون تدريباً كاملاً وخاضعين للإشراف في البداية. تتسبب بعض أعطال الأجهزة في حدوث إخفاقات كارثية ، مما يؤدي إلى عدم تضخيم البيانات أو بيانات الفلورسنت بينما يقوم البعض الآخر بتشويه البيانات أو معالجة العينات بطريقة غير موحدة مما يؤدي إلى اختلافات مصطنعة بين العينات البيولوجية المتطابقة. استخدام عينات التحكم مع فحوصات التحكم لا يقدر بثمن لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. عند الاشتباه في وجود عطل في الجهاز ، يجب إجراء اختبار موثوق ومحسن في جميع الآبار. سيكشف فحص التوحيد هذا عن المشكلات الخاصة بمناطق الأداة بالإضافة إلى مشكلات الفحص والأداة المنفصلة.

بعد تشغيل PCR جيد التخطيط ، هناك العديد من أدوات التشخيص المتاحة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها:

  • عينات التحكم والمقايسات
  • جل نقطة النهاية / كاشف صبغ SYBR Green I
  • مخططات التضخيم (تحقق من التكرارات وملف تعريف مخطط التضخيم)
  • المنحنيات القياسية (التدرج و R2) / سلسلة التخفيف
  • مخططات الذوبان / التفكك (صبغة SYBR Green I ، منارات جزيئية ، مجسات Scorpions®)
  • البيانات الخام / طرق العرض متعددة المكونات

عينات التحكم / ردود الفعل

يوصى بشدة باستخدام أدوات التحكم. يكاد يكون من المستحيل استكشاف أخطاء اختبار فاشل وإصلاحها بدون معلومات من مجموعة مناسبة من عناصر التحكم.

الشكل 11.4. أ) فشل القالب غير المخفف في التضخيم بينما تظهر التخفيفات كفاءة تضخيم محسنة. ب) إضافة 0.3٪ BSA إلى مزيج qPCR يدعم التضخيم من القالب غير المخفف.

يمكن أن تكون التحقيقات في اختبار فاشل تمامًا أمرًا صعبًا نظرًا لوجود القليل من المعلومات للعمل معها لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. نظرًا لأن العديد من حالات فشل الفحص ناتجة عن بعض الأخطاء الكارثية ، فيجب أن يكون الفحص الأول هو التحقق من إعداد التجربة ثم إعادة اختبار PCR. إذا فشل ذلك ، فإن عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها تعتمد على المعلومات المتعلقة بكل مكون من مكونات التجربة (الشكل 11-5).

الشكل 11.5. عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأساسية لـ PCR.

When a qPCR experiment completely fails, the first step is to check assay design, the oligo sequences and the QC data from the oligo manufacturer. Although the assay may have failed, qPCR multicomponent/raw data can be used to provide further information. Figure 11.6A shows the raw data plot for two assays containing either a 6-FAM™ or a HEX™ (VIC ® ) labeled probe. Although both assays show amplification, the HEX signal is approximately half of that of the FAM signal. Since this is an inherently weaker dye, this is a normal observation. The agarose gel analysis (Figure 11.6B) shows both reactions yield a similar concentration of products, supporting the observation that the qPCR Cف values are similar.

Figure 11.6. أ) The raw data plots of a duplex assay containing a FAM and a HEXlabeled probe. The FAM probe naturally yields higher fluorescence. B) The agarose gel showing that equal quantities of product were produced in each reaction and confirms the qPCR Cq observation.

Examination of the raw data is a useful check to verify that the probe is labeled correctly and was added to the reaction. Figure 11.7 shows the raw data for the amplification of three targets in a triplex experiment. The probes specific to each target are labeled with FAM, HEX and TAMRA. The HEX and TAMRA probes show a low background and efficient amplification, however the FAM signal is consistently high throughout the experiment and there is no evidence of amplification. This is consistent with too high probe concentration in the reaction or a fault with the probe such that there is no initial quenching of the signal. In such cases the probe concentration and assay design should be verified, ensuring that the probe has a compatible label and quencher and, if required, a new probe tested.

Figure 11.7. A triplex reaction was used to detect three targets using probes labeled with FAM, HEX and TAMRA. The HEX and TAMRA probes yielded amplification from the targets but the FAM probe showed no amplification. Examination of the raw data revealed that the background fluorescence was exceptionally high and no difference was observed throughout the reaction. This is consistent with too high a probe concentration in the reaction or a faulty probe with inadequate quenching.

If the original experiment relied upon probe detection the assay should be repeated using SYBR Green I reagents, including a positive and negative control (but not precious samples). Alternatively the products of a failed reaction can be checked on an ethidium bromide stained agarose gel. Adopting the SYBR Green I approach for repeating the experiment is preferable because it avoids the risk of contamination and provides a repeat experiment to verify the initial failure. If the SYBR Green I experiment provides data, it is possible that the original probe failure was due to either a technical error or probe fault. To differentiate between experimental error or a fault with the probe, repeat the probe experiment if the reaction fails again, replace the probe. This approach can be adopted to investigate reactions that are producing poor data. In the example shown in Figure 11.8, the probe reaction was sub-optimal and when compared to the reaction run using SYBR Green I, it can be seen that the probe signal does not reflect the experiment. In such cases the assay design should be verified and a new probe tested.

Figure 11.8. Identical reactions were run containing either a qPCR probe or SYBR Green I dye (as indicated). The SYBR Green I reaction was approximately eleven cycles more sensitive and yielded much higher end-point fluorescence. This is indicative of a fault in the probe or problem with the probe design (data kindly provided by Prof. Stephen Bustin, UK).

Validating probe labeling

The raw data or multicomponent plot is a useful diagnostic tool to investigate whether the appropriate concentration of probe has been included into the reaction and that the probe is adequately labeled and quenched. Figure 11.9 shows the multicomponent plot for a reaction containing three probes. The first two generate amplification plots and background fluorescence is evident. There is no data from the third probe and an examination of the raw data reveals that the background fluorescence is equivalent to the water blank control which does not contain any probe. Therefore, this data is the result of absence of fluorescence in the reaction. This would be due to an error during set up in which the probe was not included or that the probe was not labeled.

Figure 11.9. Three genes were detected in the same template sample. Two reactions resulted in amplification (1 and 2), however the 3rd was negative. An examination of the multicomponent view reveals that the background fluorescence for the 3rd reaction is equivalent to the water control indicating an absence of signal.

A further check of the probe labeling can be performed using a DNase I digestion. This must be performed with extreme care to ensure that probe and primer stocks are not contaminated with enzyme, which would lead to catastrophic results. An aliquot of a failing probe (Figure 11.10A) equivalent to that included in a reaction, e.g., 300 nM is incubated with and without DNase I. This can be carried out in real time (Figure 11.10B) such that the fluorescent yield is measured with respect to time or alternatively, the initial and end point (after 10 min) reading provide sufficient information. When performing this test it is important to compare the data to a probe that is functioning well and has the same fluorescent label and quencher (Figure 11.10B).

Figure 11.10. أ) Two templates were detected using different probes, both FAM labeled. While detection using one probe resulted in a high fluorescent signal, the second was much weaker. B) A control and a test probe (300 nM) were incubated at 37 °C in a real time instrument in DNase I buffer in the presence or absence of DNase I enzyme. The fluorescent release from probe 1 was approximately twice that from probe 2, demonstrating that probe 2 labeling was inadequate.

Amplification Plots

The structure of the amplification plots and the reproducibility of technical replicates provide a wealth of information regarding the quality of the qPCR assay and may also provide the first warning indications that all is not as it should be. The amplification plots in Figure 11.11A are non-typical, very noisy and would be difficult to interpret accurately. A further examination of the dR fluorescence values reveals that the end-point fluorescent yield is only 400 units, indicating that the reaction is inadequate but the amplification plots have been generated by the instrument software and autoscaled. Similarly, the data in Figure 11.11B have a pronounced foxtail (decreasing curve) at the beginning of the profile, before increasing again after a baseline section. The appearance of the foxtail is consistent across two reactions, but one reaction has a much lower end-point (Figure 11.11C) resulting in an amplified, relative foxtail.

Figure 11.11. أ) Amplification plots that are noisy due to autoscaling by the instrument software of poor data with low fluorescence. B) Reactions yielding low end point dR have a pronounced initial foxtail. C) The foxtail is seen as a normal effect when in proportion to the high quality assay.

Similarly, the amplification plots in Figure 11.12A are clearly abnormal and could not be used as they are presented. An amplification plot which dips below zero dR (Figure 11.12A) is a classic indication of inappropriate baseline settings having been applied. Examination of the raw data for this reaction (Figure 11.12B) shows that the actual amplification plots have a normal profile, confirming that the analyzed data are the result of an instrument software issue. The appropriate baseline can be deduced from the raw data and applied in the software. In this case cycles 6 to 16 represent the initial linear, baseline phase of the reaction and when applied, result in normal amplification plots (Figure 11.12C).

Figure 11.12. أ) Amplification plots were clearly abnormal with a section of the profile dipping below the baseline. B) Examination of the raw data plot reveals that the reaction data are as expected. C) Setting the instrument baseline according to the appropriate cycles restores the normal profile to the data of analyzed amplification plots.

The amplification plot profile can also be interpreted to give information about the quality of the assay and optimization. Figure 11.13 shows the attempted amplification of a 10‑fold serial dilution of template with each concentration run in duplicate qPCR. The reproducibility between replicates is poor, the cycle difference (ΔCف) between the data is not constant and it is not 3.323 cycles, as expected for a 10-fold serial dilution. Examination of the amplification plots, with consideration to this being a standard curve, reveals that the assay is below standard and could not be used for analysis. The reasons would need further investigation but could be the result of poor assay design (see PCR/qPCR/dPCR Assay Design), sub-optimal assay conditions (see Assay Optimization and Validation), or poor pipetting (repeat assay).

Figure 11.13. A cDNA sample was diluted through a 10-fold serial dilution and the specific template detected using duplicate qPCR for each dilution. The replicates are poor, indicating a problem with pipetting or with assay optimization.

Figure 11.14. During a standard qPCR the data suddenly spike upward with a non-typical profile.

Figure 11.15. For declining or hooked fluorescence plots, the possible cause may be due to the complementary strand competing with the primer and/or probe for annealing to template. Ignore as long as Ct is not affected


The equation for using multiple reference genes to calculate the relative gene expression is displayed below.

The first thing I will say is: don’t panic! It is actually not as confusing as it looks. It is actually very similar to the Pfaffl equation, the only difference here being the geometric averaging of all the relative quantities (RQ), i.e. the (EREF) ∆Ct REF part, of the multiple reference genes used on the denominator (bottom) part of the equation.

ال ه in the equation refers to the base of exponential amplification. A value of 2, like in the delta-delta Ct method, indicates that after each PCR cycle, the amount of product will double. In other words, a value represents a 100% efficient reaction.


النتائج

Efficiencies were calculated above 97% for all TaqMan and SYBR Green analysis [ Table 2 ]. Standard curves for SYBR Green and TaqMan analysis showed in [Figures ​ [Figures1 1 and ​ and2] 2 ] respectively.

الجدول 2

Calculated efficiencies of two methods

Standard curves of SYBR Green method, (a) A1 adenosine receptor, (b) A2A Adenosine receptor, (c) A2B adenosine receptor (d) A3 adenosine receptor, (e) B. actin

Standard curves of TaqMan method, (a) A1 adenosine receptor, (b) A2A Adenosine receptor, (c) A2B adenosine receptor (d) A3 adenosine receptor, (e) B. actin

The average values of normalized adenosine receptors gene expression levels were 1.44, 2.38, 3.79 and 3.55 for A1, A2A, A2B and A3 adenosine receptors for SYBR Green method and value for TaqMan method were 1.38, 2.43, 3.84 and 3.58 [ Table 3 ] respectively.

الجدول 3

Adenosine receptors expression levels in breast cancer

In the case of association between data of gene expression resulting from TaqMan and SYBR Green, Pearson analysis showed a significant and positive correlation between all method-pair gene expression analysis Table 4 .

الجدول 4

Correlation between results of SYBR Green and TaqMan methods


Advantages of Multiplex PCR

1. Internal Controls
Potential problems in a simple PCR include false negatives due to reaction failure or false positives due to contamination. False negatives are often revealed in multiplex assays because each amplicon provides an internal control for the other amplified fragments.

2. Efficiency
The expense of reagents and preparation time is less in multiplex PCR than in systems where several tubes of uniplex PCRs are used. A multiplex reaction is ideal for conserving costly polymerase and templates in short supply.

3. Indication of Template Quality
The quality of the template may be determined more effectively in multiplex than in a simple PCR reaction.

4. Indication of Template Quantity
The exponential amplification and internal standards of multiplex PCR can be used to assess the amount of a particular template in a sample. To quantitate templates accurately by multiplex PCR, the amount of reference template, the number of reaction cycles, and the minimum inhibition of the theoretical doubling of product for each cycle must be accounted.



تعليقات:

  1. Kendrew

    عبارة رائعة

  2. Shaktijas

    الجواب السلطوي الغريب ...

  3. Matei

    برافو ، يا لها من رسالة ممتازة

  4. Darroch

    ما زلت أعرف قرارًا

  5. Groshakar

    أنت تمزح؟

  6. Alcyoneus

    الآن هذا شيء مثل ذلك!

  7. Ethelbert

    لديك مدونة جيدة.

  8. Meztigal

    إنه لأمر مؤسف ، أنني الآن لا أستطيع التعبير - لقد تأخرت على الاجتماع. سيتم إطلاق سراحي - سأعبر بالضرورة عن رأيي في هذا السؤال.



اكتب رسالة