معلومة

لماذا لا تستخدم SDS-PAGE كطريقة للكشف عن الفيروسات؟

لماذا لا تستخدم SDS-PAGE كطريقة للكشف عن الفيروسات؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في الآونة الأخيرة ، كنت أبحث عن الحمض النووي وأعلم أن الطريقة الأكثر شيوعًا للكشف عن الفيروسات تعتمد على الحمض النووي. بعد التعرف على البروتينات ، أتساءل لماذا لا نكتشف الفيروسات بناءً على بروتينات الفيروسات؟

إذا أصبح هذا صحيحًا ، فيمكننا توفير الكثير من المال ، بدلاً من إجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يمكننا اكتشاف أكثر من مرض في تفاعل واحد.

على سبيل المثال ، عندما يكون لدي تسلسل فيروس من بنك NCBI Genebank ، يمكنني معرفة عدد البروتينات التي ينتجها الكائن المستهدف ويمكنني حساب الوزن الجزيئي لكل بروتين. ثم تشغيله في هلام SDS-PAGE لمعرفة كيف تبدو العصابات ، هل يمكنني معرفة أن الكائن المستهدف موجود أم لا؟

على سبيل المثال ، ينتج فيروس نقص المناعة البشرية 9 بروتينات ويختلف الوزن الجزيئي لكل بروتين. إذن بعد إجراء الرحلان الكهربائي ، لدي 9 نطاقات. بناءً على المسافة بين كل شريط واستناداً إلى الوزن الجزيئي ، هل من الممكن معرفة وجود فيروس نقص المناعة البشرية أم لا؟


ببساطة ، الجواب هو أنك استطاع تسعى لاكتشاف البروتينات الفيروسية ، ولكن نظرًا لأن هذه البروتينات ستكون مكونات ثانوية جدًا في عينتك ، فسيتعين عليك استخدام تقنية مناعية للكشف عن بروتين فيروسي معين. في حين أن التجلط المناعي هو أسلوب حساس للغاية ، أعتقد أنه من العدل أن نقول إنه يمكن أن يكون متطلبًا تقنيًا. في المقابل ، يكون تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل حساسًا للغاية وقويًا إلى حد ما. يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أيضًا أكثر قوة من الناحية الفنية لأن الحمض النووي أسهل في العمل معه بشكل عام من البروتينات.

قبل ظهور تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كان التجلط المناعي هو الطريقة المفضلة.


الطرق الجزيئية لاكتشاف الفيروسات

تم وصف إجراءات التشخيص الجزيئي في عدد من الكتب والمقالات الحديثة. ومع ذلك ، لم تركز هذه المنشورات على اكتشاف الفيروسات ، ولم تقدم بروتوكولات عملية للطرق الجزيئية الأحدث.

مكتوبة من قبل المخترعين أو المطورين الرئيسيين لهذه التقنيات ، الطرق الجزيئية لاكتشاف الفيروسات يقدم كلا من المراجعات للطرق الفردية والتعليمات للكشف عن تسلسل الحمض النووي للفيروس في العينات السريرية. يتضمن كل إجراء بروتوكولات ضمان الجودة التي غالبًا ما تتجاهلها كتب المنهجيات الأخرى. الطرق الجزيئية لاكتشاف الفيروسات يوفر الإجراءات ذات الصلة سريريًا للعديد من منهجيات التشخيص الحديثة.

تم وصف إجراءات التشخيص الجزيئي في عدد من الكتب والمقالات الحديثة. ومع ذلك ، لم تركز هذه المنشورات على اكتشاف الفيروسات ، ولم تقدم بروتوكولات عملية للطرق الجزيئية الأحدث.

مكتوبة من قبل المخترعين أو المطورين الرئيسيين لهذه التقنيات ، الطرق الجزيئية لاكتشاف الفيروسات يقدم كلا من المراجعات للطرق الفردية والتعليمات للكشف عن تسلسل الحمض النووي للفيروس في العينات السريرية. يتضمن كل إجراء بروتوكولات ضمان الجودة التي غالبًا ما تتجاهلها كتب المنهجية الأخرى. الطرق الجزيئية لاكتشاف الفيروسات يوفر الإجراءات ذات الصلة سريريًا للعديد من منهجيات التشخيص الحديثة.


5.1 ضمان جودة المختبر

من أجل بناء القدرات المختبرية ، يجب أن تستثمر برامج فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز الوطنية في برنامج ضمان الجودة لجميع المختبرات التي تقوم بإجراء الاختبارات التشخيصية ، ويجب أن تستخدم الخدمات المتاحة الحالية التي تقدمها منظمة الصحة العالمية وغيرها بما في ذلك مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) لدعم خارجي مخططات تقييم الجودة (EQAS).

لا يضمن إجراء اختبارات عالية الدقة بالضرورة نتائج معملية موثوقة. يتم تضمين العديد من العمليات من وقت جمع العينة ونقلها إلى المختبر ، واختبارها وحتى الإبلاغ عن النتائج ، والتي يمكن أن تحدث خلالها الأخطاء. لذلك ، فإن ضمان الجودة المستمر في سياق نظام جودة المختبر ، داخليًا وخارجيًا ، أمر ضروري. يحتاج الأطباء والموظفون الذين يقدمون خدمات المختبر إلى اتصالات منتظمة حول أداء الاختبارات لتحسين وضمان الأداء المناسب. تعد إجراءات التشغيل القياسية المحددة جيدًا (SOPs) ، التي تتبع خوارزميات الاختبار المحددة على المستوى الوطني والتي تم التحقق من صحتها ، ضرورية للاستخدام الأمثل لجميع الاختبارات المعتمدة على المختبر.


جل التراص لا يفيد في التحليل ويمكن إزالته. يشير الجزء العلوي من الجل إلى الجزء العلوي من هلام الفصل ، أي النقطة التي بدأت عندها بولي ببتيدات مختلفة في الانفصال. يتكون مزيج معايير البروتين عادةً من خمسة إلى ثمانية عديد ببتيدات فردية تنتج حصادًا بارزة & quot ؛ يتم تحديد المعايير من أعلى إلى أسفل. اعتمادًا على٪ T ، قد لا يتم حل واحد أو أكثر من معايير الكتلة الأدنى.

لإعداد منحنى قياسي للكتلة الجزيئية ، يقدر المرء الحراك النسبي لكل معيار ويرسم منحنى قياسي للكتلة الجزيئية مقابل التنقل النسبي على ورق شبه لوغاريتمي أو كتلة جزيئية لوغاريتمية مقابل التنقل النسبي على ورق الرسم البياني التقليدي. يتم تحديد التنقل النسبي عن طريق قياس المسافة من الجزء العلوي من الجل إلى منتصف واجهة الصبغة أو نقطة مرجعية عشوائية ، وقياس المسافة من الجزء العلوي من الجل إلى منتصف النطاق ، وقسمة القياس الثاني على الأول . هذا هو Rf ، وهو دائمًا ما بين 0 و 1.

لاحظ أن الحركة النسبية لبروتين معين تعتمد على تركيز الهلام. أي هلام منفرد له حد علوي وسفلي لنطاقه المفيد لتقدير الكتلة الجزيئية.


3. زراعة الخلايا (زراعة الأنسجة)

هناك ثلاثة أنواع من زراعة الأعضاء لزراعة الأنسجة ، وزراعة النبات النباتى ، وزراعة الخلايا.

ثقافات الأعضاء يتم إجراؤها بشكل أساسي للطفيليات عالية التخصص لأعضاء معينة مثل تتم زراعة حلقة القصبة الهوائية لعزل الفيروس التاجي.

ثقافة اكسبلانت نادرا ما يتم ذلك.

زراعة الخلايا يستخدم في الغالب لتحديد وزراعة الفيروسات.

  • زراعة الخلايا هي العملية التي تنمو بها الخلايا في ظل ظروف خاضعة للرقابة.
  • تزرع الخلايا في المختبر على زجاج أو سطح بلاستيك معالج في وسط نمو مناسب.
  • في وسط النمو الأول ، يتم أخذ محلول ملح متوازن يحتوي على 13 من الأحماض الأمينية والسكر والبروتينات والأملاح ومصل العجل والمانع والمضادات الحيوية وأحمر الفينول ويتم تلقيح النسيج أو الخلية المضيفة.
  • عند الحضانة ، تنقسم الخلية وتنتشر على السطح الزجاجي لتشكيل طبقة أحادية متكدسة.

الطرق التي تكشف عن جزيئات العاثية الكاملة

يستخدم المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) شعاعًا من الإلكترونات لإنتاج دقة أعلى بمقدار 1000 مرة مقارنة بالمجاهر الضوئية التقليدية. الدقة المتزايدة (حتى 0.2 نانومتر) كافية لتصور حتى الفيروسات. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد كمية الجزيئات الفيروسية ، على الرغم من أن العينة تحتاج إلى تركيز عالٍ (& # x223C10 6 جزيئات / مل) لتحقيق نتائج موثوقة (Mann، 2005 Goldsmith and Miller، 2009). يعتبر القياس الكمي الفيروسي باستخدام TEM دقيقًا للغاية في تحديد نوع الصورة والعدد الإجمالي ، ولكنه يعتبر مضيعة للوقت ومكلفًا وغير عملي لتشغيل العديد من العينات ولا يمكن استخدامه لعينات معقدة. علاوة على ذلك ، يعد تحضير العينة مملاً وتتطلب التقنية عاملًا ماهرًا فوق الأداة المتطورة (أكرمان ، 2012).

طريقة أخرى لحساب الجسيمات الكاملة هي قياس التدفق الخلوي. هنا ، يتم تمييز الجسيمات الفيروسية بصبغة الفلورسنت وتوجيهها من خلال الشعيرات الدموية. القطر الصغير للشعيرات الدموية يجبر الجسيمات على التدفق في خط واحد ، مما يسمح باكتشاف تشتت الضوء الناجم عن كل جسيم. الطريقة سريعة وصارمة ، وبالتالي يتم استخدامها على نطاق واسع (Picot et al. ، 2012). أظهرت دراسة أساسية أن إشارة الفلورسنت لا ترتبط بحجم الجينوم ، ولكن يمكن تمييز الفيروسات المختلفة في عينة مختلطة بناءً على مضانها وتوزيع الانتثار الجانبي (Brussaard et al. ، 2000). في الآونة الأخيرة ، تبين أنه يمكن استخدام إشارة الفلورسنت لربط عدد جزيئات الحمض النووي المستهدفة بعدد الجسيمات الفيروسية فقط إذا تم التعامل مع العينات برفق ، وتم تجنب استخدام المواد الخافضة للتوتر السطحي ، وتم تضمين عناصر التحكم السلبية لتحديد التألق التلقائي من الوسيط وحساسية الأداة والمقايسة يتم تقديرها مسبقًا ، باستخدام لوحة من العاثيات ذات أحجام الجينوم المختلفة (Dlusskaya et al. ، 2019).

أخيرًا ، تسمح الطريقة القائمة على الليزر التي طورتها شركة NanoSight Limited بالتخيل في الوقت الفعلي وتعداد الجسيمات الفيروسية في دقائق قليلة بناءً على تشتت الضوء الديناميكي بواسطة الفحص المجهري الضوئي بإضاءة الليزر. تتمثل العوائق في الحاجة إلى تركيز عينة مرتفع نسبيًا (10 7 & # x201310 9 PFU / مل) والسائل الصافي (Anderson et al. ، 2011) الذي يصعب الحصول عليه من عينات معقدة مثل التربة والمواد البرازية.


النشاف

بعد فصل مزيج البروتين ، يتم نقل نطاقات البولي ببتيد إلى حامل غشاء. لهذا الغرض ، يتم توصيل الغشاء بالجيل ويتم نقل هذه الشطيرة المزعومة إلى غرفة الرحلان الكهربائي. من الممكن أن يتم غسل بعض SDS ، ويعود البروتين جزئيًا إلى طبيعته مرة أخرى ، أي يستعيد هيكله ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد. ومع ذلك ، فإن الشحنة الكهربائية المطبقة تجعل البروتينات تنتقل من الهلام عموديًا إلى الاتجاه الذي تنتقل فيه على الهلام إلى الغشاء. وبالتالي ترتبط عصابات البروتين بالغشاء. النطاقات "المنشطة" متاحة الآن لمزيد من العلاج (على سبيل المثال لاكتشاف بروتينات معينة بأجسام مضادة محددة).


الكميات من الأحماض النووية

تقدير تركيز الحمض النووي على هلام ملطخ ببروميد الإيثيديوم

يستخدم Agarose الكهربائي للهلام بشكل شائع لفصل أجزاء الحمض النووي بعد هضم نوكلياز تقييد أو تضخيم PCR. يتم الكشف عن الشظايا عن طريق تلطيخ الجل بصبغة الإقحام ، بروميد إيثيديوم ، متبوعًا بالتخيل / التصوير تحت الضوء فوق البنفسجي. يقوم بروميد الإيثيديوم بتلطيخ الحمض النووي بطريقة تعتمد على التركيز بحيث أنه كلما زاد عدد الحمض النووي الموجود في شريط على الجل ، زادت كثافة تلطخه. هذه العلاقة تجعل من الممكن تقدير كمية الحمض النووي الموجودة في النطاق من خلال المقارنة مع مجموعة أخرى من كمية الحمض النووي المعروفة. إذا كانت شدة النطاطين متشابهة ، فإنها تحتوي على كميات مماثلة من الحمض النووي. يلطخ بروميد الإيثيديوم DNA و RNA أحادي الجديلة فقط بشكل سيئ للغاية. لن تعطي هذه الأشكال من الحمض النووي تقديرًا كميًا موثوقًا به عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام.


عينة تمسخ

تم استخدام العديد من المخازن المؤقتة للعينات من أجل SDS-PAGE ولكن جميعها تستخدم نفس المبادئ لإفساد العينات. نحصل على تمسخ جيد عن طريق تحضير عينة لتركيز نهائي من 2 مجم / مل بروتين مع 1٪ SDS ، 10٪ جلسرين ، 10 ملي مولار Tris-Cl ، pH 6.8 ، 1 ملي إيثيلين ديامين تتراسيتيك حمض (EDTA) ، عامل اختزال مثل مثل dithiothreitol (DTT) أو 2-mercaptoethanol ، وقليل من البروموفينول الأزرق ليكون بمثابة صبغة تتبع (

نقوم بإعداد تركيز 2x من محلول العينة الذي يتكون من 2٪ SDS ، و 20٪ جلسرين ، و 20 ملي مولار من Tris-Cl ، ودرجة الحموضة 6.8 ، و 2 ملي مولار من إيثيلين ديامين تتراكتيك أسيد (EDTA) ، و 160 ملي ديثيوثريتول (DTT) ، و 0.1 مجم / مل برومفينول صبغة زرقاء. أنا أفضل DTT على 2-مركابتوإيثانول لأن الأخير له رائحة كريهة أقوى بكثير ولا يفسد أجزاء الدم لدينا بشكل جيد. جزء من المشكلة هو أن حمامات الماء لدينا لا تصل إلى درجة الغليان ، وقد يكون الغليان ضروريًا باستخدام مركبتين مركبتينول. نقوم بإعداد جميع المجهول لدينا بنفس التركيز ثم نمزج عينة واحدة محضرة بحجم واحد إلى مخزن مؤقت بحجم 2x.

إذن ، ماذا تفعل المكونات المختلفة؟ EDTA هي مادة حافظة تخلب الكاتيونات ثنائية التكافؤ ، مما يقلل من نشاط الإنزيمات المحللة للبروتين التي تتطلب أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم كعوامل مساعدة. يعمل tris كمخزن مؤقت ، وهو أمر مهم للغاية لأن عملية التكديس في الرحلان الكهربائي المتقطع تتطلب درجة حموضة معينة. يجعل الجلسرين العينة أكثر كثافة من المخزن المؤقت للعينة ، لذلك ستبقى العينة في قاع البئر بدلاً من الطفو. تسمح الصبغة للمحقق بتتبع تقدم الرحلان الكهربائي.

SDS و DTT والحرارة هي المسؤولة عن التمسخ الفعلي للعينة. يكسر SDS البنية ثنائية وثلاثية الأبعاد للبروتينات عن طريق إضافة شحنة سالبة إلى الأحماض الأمينية. نظرًا لأن الشحنات المتشابهة تتنافر ، يتم تقويم البروتينات بشكل أو بآخر ، مما يجعلها على الفور بلا وظيفة. قد تبقى بعض الهياكل الرباعية بسبب الترابط ثنائي الكبريتيد (التساهمي) وبسبب الروابط التساهمية وغير التساهمية مع أنواع أخرى من الجزيئات. بالمناسبة ، اسم آخر لـ SDS هو كبريتات لوريل. قد يحتوي الشامبو الخاص بك على كبريتات لوريل - ألا يوحي ذلك بالثقة في المنتج الآن؟

العديد من البروتينات لها خصائص كارهة للماء وقد ترتبط ارتباطًا وثيقًا بجزيئات أخرى ، مثل الدهون ، من خلال تفاعل كاره للماء. يؤدي تسخين العينات إلى 60 درجة مئوية على الأقل إلى زعزعة الجزيئات ، مما يسمح لـ SDS بالارتباط في المناطق الكارهة للماء وإكمال التمسخ.

يحتوي سيستين الأحماض الأمينية على مجموعة سلفهيدريل (-SH) التي تشكل تلقائيًا رابطة ثاني كبريتيد (-S-S-) مع مجموعة سلفهيدريل أخرى في ظل ظروف طبيعية داخل الخلايا. الرابطة ثاني كبريتيد تساهمية ولا تتعطل بواسطة SDS. DTT هو عامل اختزال قوي. يتمثل دوره المحدد في تمسخ العينة في إزالة الجزء الأخير من الهيكل الثلاثي والرباعي عن طريق تقليل روابط ثاني كبريتيد.

لا تزيل معظم المحاليل المعيارية للعينات مجموعات الكربوهيدرات أو الفوسفات المرتبطة تساهميًا ، ويصعب تعطيل بعض الارتباطات مع أنواع أخرى من الجزيئات الكبيرة. تحتوي البولي ببتيدات على كميات متفاوتة من الأحماض الأمينية الأساسية والحمضية التي تضيف شحنة إلى الجزيئات ، وتتنوع الأحماض الأمينية الفردية في الوزن الجزيئي على الرغم من أنها قد تربط SDS بنفس التقارب. لذلك ، تتأثر نسبة الشحنة إلى الكتلة والحركة النسبية للعديد من البروتينات بعوامل أخرى غير الوزن الجزيئي بدقة. تعد SDS-PAGE فعالة جدًا في توفير نتائج قابلة للتكرار ، ولكن لا تعتمد على القيم الدقيقة لتحديد MW.


الكشف عن حساسية عالية لفيروس كورونا SARS-CoV-2 باستخدام تعدد إرسال تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وطريقة ميتاجينومية متعددة الإرسال تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل

تم استخدام العديد من طرق الكشف أو الإبلاغ عنها لتشخيص و / أو مراقبة SARS-CoV-2. من بينها ، تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR) هو الأكثر حساسية ، حيث يدعي اكتشاف حوالي 5 نسخ من الفيروسات. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أن 47-59 ٪ فقط من الحالات الإيجابية تم تحديدها بواسطة RT-PCR ، ربما بسبب فقدان أو تدهور الحمض النووي الريبي للفيروس في عملية أخذ العينات ، أو حتى طفرة في جينوم الفيروس. لذلك ، يعد تطوير طرق حساسة للغاية أمرًا ضروريًا لضمان قدرات الكشف القوية. بهدف تحسين الحساسية واستيعاب إعدادات التطبيق المختلفة ، قمنا بتطوير طريقة قائمة على تعدد الإرسال PCR تتألف من 172 زوجًا من البادئات المحددة ، وأثبتنا كفاءتها في اكتشاف SARS-CoV-2 بأرقام نسخ منخفضة. أنتج الاختبار قممًا مستهدفة نظيفة ذات أحجام محددة ، مما سمح بالتعرف المباشر على الإيجابيات عن طريق الرحلان الكهربي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يوفر التسلسل الاختياري مزيدًا من التأكيد بالإضافة إلى معلومات عن النشوء والتطور للفيروس (الفيروسات) المحددة لتمييز سلالة معينة ، والتي ستكون ذات أهمية قصوى لأغراض المراقبة التي تمثل ضرورة صحية عالمية. أخيرًا ، طورنا أيضًا بالتوازي طريقة ميتاجينوم متعددة تستند إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قابلة للكشف عن SARS-CoV-2 ، مع فائدة إضافية تتمثل في قدرتها على الكشف عن التنوع الطفري ومسببات الأمراض الجديدة عند عمق تسلسل منخفض.


شاهد الفيديو: Separating Proteins using SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS page (قد 2022).